脂肪是一个复杂且异常活跃的组织,其在众多转录因子的调控下参与体内多种生物学进程,如能量均衡、炎症、免疫等。此外,脂肪组织功能一旦出现紊乱的状况,机体内也会相应地出现各种相关的疾病,如肥胖、心血管疾病、II型糖尿病等。micro RNAs(miRNAs)是一种小单链非编码RNA(约22个核苷酸),其通过降解靶基因m RNA或者阻遏其翻译来发挥生物学功能。近年来研究发现,miRNAs在机体的脂肪生长发育方面也起着关键性作用,但大多研究集中在肥胖以及相关的代谢疾病等方面,而关于牛脂肪方面的miRNAs功能研究相对较少。因此,本研究首先检测胎牛、犊牛和成年牛的心、肝、脾、肺、肾、肌肉和脂肪组织中miR-204相对表达量。然后,通过在线分析软件对多个物种的miR-204成熟序列进行了序列比对,并研究了其在物种间的保守性。本研究通过qPCR、CCK8、Ed U、流式细胞仪检测、油红O染色、Western blot、双荧光素酶报告系统等方法对miR-204在脂肪细胞生长发育中的作用、靶基因以及遗传变异进行了研究。获得如下重要研究结果:1.miR-204在牛上的时空表达谱分析以及物种间序列保守性分析利用qPCR检测秦川牛胎牛、犊牛和成年牛的心、肝、脾、肺、肾、肌肉和脂肪组织中miR-204相对表达量,发现miR-204在3个不同时期肾脏组织中的表达量最高,但只在肝脏和脂肪组织中存在显著性差异表达(P<0.05),表明miR-204在脂肪生长发育中扮演着重要的角色。利用生物信息学软件分析发现,miR-204成熟序列在人、鸡等多物种间呈现高度保守性,其中包括牛和小鼠。2.miR-204在脂肪细胞中的功能研究2.1 miR-204对脂肪细胞增殖的作用将miR-204模拟物(mimics)及其阴性对照(NC)分别转染至3T3-L1细胞进行培养,24 h后收细胞,qPCR检测脂肪细胞增殖标志基因Cyclin D1、Cyclin E以及CDK2的m RNA表达量,CCK8、Ed U、流式细胞仪以及Western blot检测结果表明,过表达miR-204对脂肪细胞细胞增殖没有显著性作用。2.2 miR-204对脂肪细胞分化的作用qPCR检测脂肪细胞分化关键基因PPARγ、AP2和C/EBPα的mRNA表达量,发现过表达miR-204能显著地促进PPARγ和AP2基因的表达(P<0.05)。通过油红O染色试验,发现其能够促进脂滴生成。Western blot检测发现,过表达miR-204能显著地上调FABP4蛋白表达量。以上结果表明,miR-204可以促进脂肪细胞分化。2.3 miR-204对脂肪细胞凋亡的作用qPCR检测脂肪细胞凋亡标志基因Caspase3、Bax和Bcl-2的m RNA表达量,发现过表达miR-204能显著性提高Caspase3和Bax基因表达量,显著性降低Bcl-2基因表达量(P<0.05)。流式细胞仪检测发现,miR-204能够使凋亡时期的细胞数目明显增多(P<0.05)。Western blot检测发现,过表达miR-204能在蛋白水平上显著地上调Bax表达量,显著地下调Bcl-2表达量。以上结果表明,miR-204促进脂肪细胞凋亡。3.miR-204靶基因验证借助Target Scan软件预测miR-204的全部靶基因,初步从中筛选出7个与脂肪发育相关的靶基因(ELOVL6、TGFBR2、KLF12、ACSL4、DMTF1、TGFBRAF1和PPARGC1A)。分别构建7个基因的3’UTR与miR-204种子区结合的野生型结合位点以及突变型结合位点的psi-Check2载体。分别提取质粒,转染至293T细胞,通过双荧光素酶报告系统检测相关荧光值的变化,并利用qPCR技术筛选验证出TGFBR2和ELOVL6为miR-204的靶基因。4.miR-204及其相关调控网络基因的遗传变异研究利用DNA混池测序,对miR-204及其调控网络基因(如:SIRT1、ADNCR)的序列进行扫描和遗传变异位点发掘。然后,在秦川牛和夏南牛共计436个个体上进行基因型分型检测并分别与牛的生长性状进行关联分析,发现miR-204和其调控网络基因SIRT1以及ADNCR的遗传变异位点均与秦川牛的坐骨端宽呈现显著性相关,且miR-204还与秦川牛的体长显著相关(P<0.05)。综上所述,本研究揭示了miR-204在脂肪细胞生长发育中的促分化和促凋亡作用,筛选和验证出miR-204的靶基因TGFBR2和ELOVL6,并对miR-204及其调控网络基因SIRT1和ADNCR的遗传变异进行研究。以上结果为进一步研究脂肪细胞生长发育的繁杂调控网络和改进动物肉质提供理论基础,同时也为医治肥胖等疾病提供理论参考。