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研究表明,第三代溶瘤单纯疱疹病毒G47δ（Herpes simplex Virus G47delta,简称G47δ）,具有较第二代溶瘤单纯疱疹病毒G207特异性地杀伤肿瘤细胞的能力更强、速度更快。内源性血管生长抑制因子可抑制肿瘤原发灶和转移灶的生长,具有无免疫源性,不良反应轻等优点。丝裂霉素C（Mitomycin C,MMC）广泛用于膀胱尿路上皮癌（简称膀胱癌）术后的膀胱灌注化疗。联合应用G47δ与内源性血管生长抑制因子或MMC抗膀胱癌,可能发挥协同作用。研究目的1.探讨能否从人膀胱癌组织克隆出Kringle 5基因（简称K5）,并鉴定其原核表达蛋白有无生物学活性。2.探讨G47δ、pcDNA3.1/K5对膀胱癌细胞的增殖抑制作用,二者联合应用有无协同作用。3.探讨联合应用G47δ和MMC对膀胱癌细胞的协同杀伤作用。4.探讨能否从人膀胱癌组织克隆出Endostatin基因（简称ES）,并把ES与K5拼接构建成融合基因的技术和方法。5.探讨膀胱癌患者血、尿及癌组织中血管生成因子和抑制因子的表达水平与膀胱癌分级、分期的相关性,为运用内源性血管生成抑制因子抗膀胱癌治疗提供依据。研究内容与方法1.K5基因的克隆、优化表达、纯化及活性鉴定:从人膀胱癌组织中提取总RNA,RT-PCR扩增K5基因;构建原核表达载体pGEX-5X-1/K5;运用工程菌表达蛋白,并对表达条件参数进行优化;带谷胱甘肽巯基转移酶（GST）标签琼脂糖4B亲和柱层析、纯化蛋白;CellTiter 96 AQueous细胞增殖检测法（MTS）检测K5蛋白对人脐静脉内皮细胞ECV304增殖的影响。2.pcDNA3.1/K5联合G47δ抗膀胱癌效应研究:提取病毒DNA,PCR扩增目的片段,进行琼脂糖凝胶电泳和基因测序鉴定G47δ构建的正确性;蚀斑实验测定G47δ的蚀斑形成单位;培养人膀胱癌细胞株BIU-87（浅表性膀胱癌）和EJ（侵润性膀胱癌）细胞;构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/K5,用脂质体PolyFect介导pcDNA3.1/K5转染BIU-87和EJ细胞,再用G47δ感染癌细胞,MTS法检测癌细胞增殖情况;构建pEGFP-n2/K5,用PolyFect介导pEGFP-n2/K5转染癌细胞,再用G47δ感染癌细胞,荧光显微镜观测K5在癌细胞中的定位变化;蚀斑实验检测pcDNA3.1/K5-PolyFect对G47δ的繁殖影响;pcDNA3.1/K5转染癌细胞后,RT-PCR检测癌细胞内K5 mRNA水平。3.G47δ联合MMC抗膀胱癌效应研究:G47δ感染癌细胞1h后,加MMC,MTS法检测癌细胞增殖情况,Chou-Talalay法推算联合用药指数并用Isobologram法分析联合用药效应;比较G47δ与野生型HSV-1对癌细胞增殖抑制作用;蚀斑实验检测MMC对G47δ病毒繁殖有无影响。4.ES基因的克隆、ES-K5融合基因拼接及其真核表达质粒的构建:从人膀胱癌组织中提取总RNA,RT-PCR扩增ES基因;重叠延伸拼接法（SOE）构建ES-K5融合基因;构建真核表达质粒pcDNA3.1/ES、pcDNA3.1/ES-K5、pEGFP-n2/ES-K5,基因测序鉴定。5.膀胱癌患者血、尿及癌组织中血管生成因子和抑制因子的检测:酶联免疫吸附试验（ELISA）检测膀胱癌患者血清、尿液中VEGF（vascularendothelial growth factor）、Angiostatin（AS）、ES、K5表达水平,免疫组织化学法（IHC）检测膀胱癌组织标本中VEGF、AS、ES、K5表达情况,分析它们与膀胱癌分级、分期的相关性。实验结果1.K5基因的克隆、优化表达、纯化及活性鉴定:PCR扩增得到282 bp基因片段,并成功插入pGEX-5X-1质粒;诱导温度为37℃,IPTG浓度为1mmol/L,时间为6h,pGEX-5X-1/K5在BL21中表达最佳;获得特异性融合蛋白,经凝血酶酶切后得到分子量约为12kD的重组K5蛋白（rK5）;rK5能特异性抑制ECV304细胞增殖,抑制率最高蛋白浓度为5μg/ml。2.pcDNA3.1/K5联合G47δ抗膀胱癌效应研究:G47δ能在Vero细胞中繁殖,并出现特征性的CPE病变;琼脂糖凝胶电泳PCR扩增的G47δ目的片段条带宽亮,位于250bp、500bp之间,而PCR扩增的HSV-1目的片段位于500bp、750bp之间,病毒DNA序列测序均正确,表明所重组G47δ构建正确;蚀斑实验计算G47δ蚀斑形成单位为2.5×107pfu/ml;pcDNA3.1/K5、G47δ对BIU-87、EJ细胞增殖有抑制作用,而且抑制率与G47δ剂量、作用时间正相关,联合作用抑制率比其单一作用要强;荧光显微镜观测,K5-EGFP融合蛋白在癌细胞胞浆、胞核中均有表达,G47δ对其定位并无影响;pcDNA3.1/K5对G47δ繁殖无明显影响,蚀斑形成单位数基本相同;pcDNA3.1/K5转染癌细胞后,RT-PCR扩增K5 mRNA条带位于250bp、500bp之间,符合K5核苷酸大小。3.G47δ联合MMC抗膀胱癌效应研究:G47δ、MMC对BIU-87、EJ细胞增殖均有抑制作用,而且抑制率与G47δ、MMC的剂量和作用时间正相关,Chou-Talalay法分析合用指数CIx＜1,Isobologram法分析q＜1,表明二者具有协同作用;G47δ对癌细胞的增殖抑制作用比野生型HSV-1明显要强;MMC对G47δ繁殖无明显影响,蚀斑形成单位数基本相同。4.ES基因的克隆、ES-K5融合基因拼接及其真核表达质粒的构建:PCR扩增得到552bp基因片段,并成功插入pcDNA3.1质粒,基因测序正确;SOE法所构建融合基因ES与K5中间的Linker为（Gly4Ser）3,ES-K5融合基因成功插入pcDNA3.1和pEGFP-n2真核表达质粒,基因测序正确。5.膀胱癌患者血、尿及癌组织中血管生成因子和抑制因子的检测:膀胱癌患者血清、尿液中VEGF、AS、ES、K5表达水平与膀胱癌分级、分期正相关;VEGF、AS、ES在癌组织中的表达也与分期正相关。结论1.K5基因的克隆、优化表达、纯化及活性鉴定:1)从膀胱癌组织能克隆出Kringle5基因。2)对蛋白表达条件参数优化后,确定诱导温度为37℃,IPTG浓度为1mmol/L,时间为6h,pGEX-5X-1/K5在BL21中表达最佳。3)含重组质粒pGEX-5X-1/K5大肠杆菌表达产物量较多且易纯化。2.pcDNA3.1/K5联合G47δ抗膀胱癌效应研究:1) pcDNA3.1/K5、G47δ对膀胱癌细胞增殖均有抑制作用,而且抑制率与G47δ剂量、作用时间正相关,pcDNA3.1/K5与G47δ联合作用抑制率比其单一作用要强。2) pcDNh3.1/K5对G47δ病毒繁殖无明显影响。3) pcDNA3.1/K5转染癌细胞后,能在细胞内稳定表达。3.G47δ联合MMC抗膀胱癌效应研究:1) G47δ、MMC对膀胱癌细胞增殖均有抑制作用,抑制率与G47δ、MMC的剂量和作用时间正相关,二者合用具有协同作用。2) G47δ对癌细胞的增殖抑制作用比野生型HSV-1明显要强。3) MMC对G47δ繁殖无明显影响。4.ES基因的克隆、ES-K5融合基因拼接及其真核表达质粒的构建:1)从膀胱癌组织能克隆出Endostatin基因。2) SOE法所构建Linker能把ES与K5拼接起来,并能成功插入到真核表达质粒中。5.膀胱癌患者血、尿及癌组织中血管生成因子和抑制因子的检测:1) VEGF、AS、ES、K5在膀胱癌中分泌表达与分级、分期正相关。2)肿瘤血管新生正性和负性调控平衡被打破的原因可能是由于血管生成因子与血管生成抑制因子表达分泌均增多、增强,但以前者更为显著。3)去除原发肿瘤后微转移灶迅速生长的原因是由于微转移灶中血管生成因子与由原发肿瘤所分泌的血管生成抑制因子来源减少而使调控平衡被打破,但这一机制不能合理解释血管生成抑制因子表达量与肿瘤分级、分期正相关的现象,有待于进一步研究。