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分子伴侣(molecular chaperone)是生物体内一类影响许多多肽结构和功能的蛋白,它们通过控制、结合和释放来帮助被结合多肽在体内进行折叠、组装、转运或降解等。在胁迫条件下,分子伴侣起稳定蛋白质结构的作用,防止蛋白质凝聚、变性,并具有修复变性蛋白的能力。ClpB具有分子伴侣功能,是Clp蛋白家族的一员。与Clp蛋白家族其他成员不同的是ClpB具有较长的中间区域;ClpA和ClpX具有ATP酶活性,可以调节ClpP介导的蛋白水解活性,ClpB不能调节ClpP介导的蛋白水解活性,但具有分子伴侣活性,能瓦解蛋白聚集体,并协同其它的分子伴侣修复变性蛋白。本实验室从番茄cDNA文库中克隆到定位于叶绿体的ClpB,分子量为110kD,命名为LeHsp110/ClpB。已有的研究结果表明,LeHSP110/ClpB在常温下不表达,受高温诱导,是典型的热诱导型基因。为了研究LeHSP110/ClpB与植物耐热性的关系,本论文利用反义技术,抑制LeHsp110/ClpB在番茄中的表达,结果表明LeHSP110/ClpB在番茄耐热性中具有重要作用。本论文主要结果如下:1、LeHSP110/ClpB的亚细胞定位利用TargetP和ChloroP软件对LeHSP110/ClpB的氨基酸序列进行了在线分析,发现预测的蛋白前体含有叶绿体定位信号肽(76个氨基酸)。根据预测结果,选取LeHsp110/ClpB cDNA 5’端345 bp的DNA片段与绿色荧光蛋白基因(gfp)融合构建嵌合载体,利用农杆菌介导的叶圆盘法转化烟草。选取PCR检测为阳性的转基因烟草,撕取叶片表皮进行激光扫描共聚焦显微镜观察,发现GFP在叶绿体部位表达,证明该蛋白确实定位于叶绿体中。2、转反义LeHsp110/ClpB番茄的获得选取LeHsp110/ClpB cDNA 5’端330 bp的DNA片段(该片段包括LeHsp110/ClpB的5’UTR区,叶绿体信号肽编码区和部分Hsp100/ClpB基因在进化上的高变异区)构建反义表达载体,利用农杆菌介导的叶圆盘法转化番茄,共得到17个独立转化系。Northern杂交结果表明,高温下反义转基因番茄中内源内源LeHsp110/ClpB基因的表达被明显抑制;Western分析结果表明LeHSP110/ClpB蛋白表达水平也显著下降。