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内皮素-1(endothelin-1,ET-1)作为强效的血管收缩因子和有丝分裂原,在高血压、冠心病、心肌肥大等疾病的发病中起重要作用。内皮细胞ET-1表达调节主要发生于转录水平。大量文献报道胰岛素能刺激内皮细胞ET-1表达;而胰岛素抵抗时的高胰岛素血症可激活机体内皮素系统,引起的ET-1表达升高,进而导致心血管细胞的增生或肥大以及血管舒缩异常。胰岛素激活PI3激酶(P13K)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)两条主要信号通路,现已知PI3K/Akt通路介导胰岛素刺激内皮细胞一氧化氮(NO)产生;但不清楚PI3K/Akt通路是否参与胰岛素刺激内皮细胞ET-1基因表达。胰岛素激活PI3K/Akt,进而磷酸化9位丝氨酸残基(Ser~9)导致糖原合酶激酶-3β(GSKβ)灭活。GSK3β是一种多功能的丝氨酸/苏氨酸激酶,可磷酸化多种转录因子并调节其活性,例如:改变转录因子与DNA的结合能力。作为胰岛素信号下游的重要激酶,GSK3β是否参与调节内皮细胞ET-1基因表达,尚未见文献报道。人ET-1基因启动子含TATA框,其活性受多种转录因子调节,如:AP-1、含锌指结构转录因子GATA-2、缺氧诱导因子-1(HIF-1);但这些转录因子的表达并不局限于血管内皮细胞;因而,这些因子单独作用不大可能引起胰岛素诱导的内皮细胞特异性基因ET-1表达。血管内皮锌指-1(Vezf1)与ET-1核心启动子结合,是调节细胞特异性基因ET-1在内皮细胞表达的潜在靶点。目前尚不清楚Vezf1是否参与胰岛素对内皮细胞ET-1表达的调节。本课题研究:(1)胰岛素对GSK3β灭活作用是否引起内皮细胞ET-1基因表达增加;(2)胰岛素上调ET-1启动子活性是否由PI3K介导;(3)Vezf1是否参与胰岛素信号对内皮细胞ET-1基因表达调节。研究目的在于阐明胰岛素调节内皮细胞ET-1表达的分子机制。材料和方法1.细胞培养人肺动脉内皮细胞(PAEC)生长于含2%胎牛血清(FBS)的EBM-2培养液中。人脐静脉内皮细胞(HUVEC),用含4%FBS的RPMI 1640培养液培养。2.胰岛素和氯化锂(LiCl)处理单层培养的人肺动脉内皮细胞(PAEC)血清饥饿6h后,加入含0-100nM重组猪胰岛素或20mM LiCl(GSK3β抑制剂)条件培养液,37℃孵育1h。用酶联免疫吸附法(ELISA)检测培养上清液ET-1多肽含量或用Real time定量RT-PCR(qRT-PCR)分析细胞ET-1 mRNA水平。部分细胞经胰岛素或LiCl处理后,用4%甲醛固定,ELISA法检测细胞的Ser~9磷酸化GSK3β和总GSK3β蛋白水平(GSK3p活性)。3.GSK3βsiRNA和Vezf1 siRNA转染内皮细胞单层PAEC分别转染GSK3βNezf1 siRNA和control siRNA(不针对某种特殊序列)。37℃孵育72h后。用ELISA法测定培养上清液ET-1含量;采用qRT-PCR分析细胞ET-1和GSK3βNezf1基因表达;siRNA对目标蛋白的抑制作用经Western blot分析证实。4.重组腺病毒Ad5-GSK3β感染内皮细胞人PAEC分别感染染重组共表达GSK3β基因和GFP基因的腺病毒表达载体(Ad5-GSK3β)和仅表达GFP基因的空白腺病毒(Ad5-GFP);细胞感染后在含或不含18nM胰岛素条件培养液中孵育1h。ELISA法检测培养上清液ET-1含量;qRT-PCR分析细胞ET-1基因表达。5.报告基因质粒构建和荧光素酶检测从人基因组DNA调取ET-1基因启动子(-832/+171bp)片断;将其插入报告基因质粒pGL3-Basic,形成重组质粒pGL3-ET1。以构建好的pGL3-ET1为基础,将其中Vezf1结合位点(-47bp处)“TTACCCCCACTC”突变成“TTACATCCACTC”,形成一个突变质粒pGL3-ET1-m。HUVEC用Lipofectin Reagent转染pGL3-ET1/pGL3-ET1-m;共转染pRL-SV40(含SV40启动子的海肾荧光素酶报告基因质粒)作为内参照。转染48h后,用100nM胰岛素刺激1、3和6h;部分细胞在胰岛素刺激前30min至刺激结束,培养液中含浓度为100nM的Wortmannin(P13K抑制剂)或10μM的PD-98059(MAPK抑制剂);双荧光素酶报告检测系统(Dual-LuciferseReporter Assay System)检测荧光素酶活性(表示ET-1启动子活性)。结果1.胰岛素刺激人内皮细胞分泌ET-1人PAEC用10、100nM胰岛素刺激1h;培养上清液中ET-1含量比对照组明显增加(P＜0.05或P＜0.01),并呈剂量依赖效应。2.GSK3β抑制剂LiCl模仿胰岛素刺激内皮细胞ET-1基因表达人PAEC用100nM胰岛素或20mM LiCl条件培养液处理1h后,GSK3β的Ser~9磷酸化水平比对照组明显增高(P＜0.01),提示LiCl模仿胰岛素抑制GSK3β活性。PAEC用10、100nM胰岛素或20mM LiCl刺激1h,细胞ET-1mRNA水平明显高于相应对照组(P＜0.05或P＜0.01)。结果表明GSK3β活性抑制与培养内皮细胞ET-1基因表达上调有关。3.特异性抑制GSK3β表达上调内皮细胞ET-1 mRNA表达和ET-1多肽释放为进一步证实GSK3β对ET-1基因表达的影响,人PAEC转染GSK3βsiRNA/control siRNA后,细胞和培养上清液分别用于qRT-PCR和ELISA分析。GSK3βsiRNA转染的人内皮细胞GSK3βmRNA表达仅为control siRNA转染细胞的20%,证实siRNA成功抑制GSK3β基因表达。GSK3p沉默分别上调ET-1mRNA表达50%(P＜0.01)和ET-1多肽释放100%(P＜0.01)。结果证实GSK3β活性抑制可上调内皮细胞ET-1 mRNA转录和ET-1多肽释放。4.过表达GSK3β基因减弱胰岛素对ET-1表达的刺激作用为阐明GSK3β在胰岛素调节ET-1产生中的作用,人PAEC感染共表达GSK3β和GFP重组腺病毒后,qRT-PCR和ELISA分别检测细胞ET-1基因转录与ET-1多肽分泌。与空白病毒(无插入片断)感染细胞相比,过表达GSK3β表达明显减弱胰岛素对ET-1 mRNA表达(P＜0.01)和ET-1多肽释放的刺激作用(P＜0.05);结果支持GSK3β负调节内皮细胞ET-1转录与ET-1分泌。5.Vezf1调节内皮细胞ET-1表达为确定Vezf1是否调节内皮细胞ET-1基因表达,人PAEC转染VeZf1 siRNA后,细胞和培养上清液用于qRT-PCR和ELISA分析。Vezf1 siRNA转染细胞Vezf1 mRNA水平仅为control siRNA转染细胞的9%,而相应ET-1 mRNA表达和ET-1多肽释放仅分别为control siRNA转染细胞的20%和40%(P＜0.01);结果表明Vezf1参与调节内皮细胞ET-1基因转录和ET-1多肽释放。6.胰岛素上调ET-1基因启动子活性由PI3K介导现有研究已经证明,细胞内胰岛素灭活GSK3β主要由PI3K介导。为确定内皮细胞中胰岛素信号刺激ET-1基因表达是否由PI3K介导,HUVEC共转染报告基因质粒pGL3-ET1和pRL-SV40,37℃孵育48h后,加入含100nM胰岛素培养液37℃,孵育1、3和6h;部分细胞在胰岛素刺激之前30min和刺激期间,培养液中含100nM的Wortmannin或10μM的PD-98059;用双荧光素酶检测试剂盒检测ET-1启动子活性。Wortmannin和PD-98059在无胰岛素刺激条件下对ET-1启动子活性无明显影响(P＞0.05);胰岛素刺激后各时间点ET-1启动子活性比对照组(无胰岛素刺激)明显增强(P＜0.05或P＜0.01);胰岛素+Wortmannin组ET-1启动子活性明显低于胰岛素单独处理组(P＜0.05或P＜0.01),而与对照组相比,无显著性差异(P＞0.05);胰岛素+PD-98059组ET-1启动子活性与胰岛素单独处理组比较,无显著性差异(P＞0.05),且明显高于对照组(P＜0.05或P＜0.01)。结果说明胰岛素上调ET-1基因启动子活性由PI3K介导。7.Vezf1参与胰岛素对ET-1基因表达的调节为证实胰岛素调节ET-1表达是否通过转录因子Vezf1发挥作用,HUVEC分别转染pGL3-ET1和Vezf1结合序列突变质粒pGL3-ET1-m;转染48h后,加入含100nM胰岛素培养液,37℃孵育6h;双荧光素酶检测试剂盒检测ET-1启动子活性。胰岛素明显上调转染pGL3-ET1内皮细胞的ET-1启动子活性(P＜0.05);而转染pGL3-ET1-m内皮细胞的ET-1启动子活性在胰岛素刺激后与对照组无明显差异。结果说明Vezf1参与胰岛素对ET-1基因表达调节。结论1.本实验首次发现PI3K-GSK3β信号通路在胰岛素调节内皮细胞ET-1基因表达中起关键作用。PI3K-GSK3β信号通路可能是胰岛素抵抗时高胰岛素血症引起内皮细胞ET-1表达增加的分子基础。2.内皮细胞特异性转录因子Vezf1参与胰岛素对内皮细胞ET-1基因表达调节。