引言 人类脑卒中发生机制非常复杂，且受循环系统基础病理情况、情绪状态、生活习惯、种族、气候等等的因素影响，难以做到有的放矢地预防。很多临床研究和流行病学资料显示，在寒冷季节，尤其是气温骤降的寒潮时，脑卒中发病明显增多1-5。在秋冬交替时节，气温骤降或者剧烈波动是脑卒中发病的预测因子3，6-9。那么，寒冷究竟如何诱发脑卒中?科普杂志和大众常识都认为，这是一个显而易见的问题，寒冷时血管痉挛、血压升高、血液浓缩就会引起中风10-13。但是，寒冷季节卒中发病率增加，不仅是缺血性卒中增加，脑出血的增加更为明显，这是血液浓缩和血浆纤维蛋白原增加都不能解释的。回顾了国内外的研究文献，我们发现，真正探索这个问题的临床和实验研究屈指可数，寒冷时卒中容易发生这一流行病学结论一致的现象并没有得到基于深入确凿的临床研究和动物实验依据的合理解释。 流行病学调查发现的另一个与寒冷诱发卒中相似的是：寒冷能够诱发高血压，这一现象已经得到了动物实验的证实：慢性寒冷诱导的高血压动物模型成功复制。但是在原有高血压基础的大鼠，寒冷会引起怎样的病理生理变化：血压怎样改变，血管张力如何变化，缺血性和出血性卒中是否会如期出现，这些变化的分子生物学机制又是如何?即是本课题的主要研究内容。 我们知道，寒冷对于机体的影响相当复杂，涉及到一个十分庞大和复杂的调控网络，要比较全面地了这一网络，仍然采用原有的研究单个基因功能的方法有如大海捞针，因此我们采用采用高通量、系统性的研究手段——基因芯片技术和蛋白组学，从总体上进行研究，为下一步在点上研究单个基因与在寒潮诱发卒中的作用提供线索。 到目前为止，绝大部分脑卒中动物模型都是通过线栓、电凝或者光化学等方法闭塞脑部的主要供血动脉，或者穿破脑供血动脉、自体血注射入颅内等人为的外科手术方法来实施的14，15。而临床上脑卒中的发生常常是在高血压等原因引起的广泛的、严重的小动脉硬化的基础上，在寒冷或者情绪波动等诱因下自发出现的，相比而言，寒潮诱发高血压动物卒中更能模拟临床卒中的发生经过。 我们课题组既往的研究显示双肾双夹法(2k2c)制作的长期高血压(8-10周左右)的肾血管性高血压大鼠(renovascularhypertensiverats，RHR)脑卒中自然发病率高，被称之为易卒中型肾血管性高血压大鼠(stroke-pronerenovascularhypertensiverats，RHRSP)16。RHRSP与SD大鼠遗传背景一致，不仅脑血管基础病变与人类相似，而且在寒潮来临时自发性脑卒中发生率显著升高16,17，是研究高血压和高血压动脉硬化性脑卒中的可靠的动物模型。因此，在本研究中，我们将RHRSP放置在模拟冬季自然寒潮的3天间歇人工寒潮环境，观察其对于高血压动物的血压、体重、脑卒中的发生率的影响以及脑、心脏供血动脉血管张力和外周血白细胞基因谱、脑组织蛋白谱表达的影响，力求通过这些研究寻找脑卒中诱发机制研究的切入点，为脑卒中的实时预防寻找理论和实验基础。 第一部分建立模拟临床的寒潮诱发脑卒中的动物模型 目的：流行病学资料显示在寒冷季节，尤其是秋冬交替时节，脑卒中发病明显增多。本研究的目的是利用人工智能气候箱和RHR建立能够模拟临床的人工寒潮(artificialcoldexposure，ACE)诱发脑卒中动物模型。方法将复制成功RHR及正常血压的SD大鼠分为寒潮(ACE)和非寒潮(non-ACE)两大组，再按血压水平各分为正常血压组及轻度、中度、重度高血压等4个亚组，单笼放置于人工气候箱，寒潮组给予3天12小时4℃/22℃交替的人工寒潮处理以观察大鼠的脑卒中发病情况。结果1.经历了3天间歇的ACE后，RHR大鼠的收缩压(systolicbloodpressure，SBP)下降，而SD大鼠的SBP稍升高，人工气候箱处理后的各组大鼠体重均有下降，ACE后更为明显；2.经历3天间歇的ACE后，RHR组脑卒中发病率明显增多，与对照组比较(29.3％vs17.3％)有明显差异(P＜0.05)。另外，在ACE和non-ACE组，脑卒中发病率在重度高血压组均明显高于轻度或者中度高血压组。结论3天间歇的人工寒潮导致RHR的体重和SBP明显下降，脑卒中的发生率明显升高，达到近似自然寒潮时的卒中率，卒中发生率主要受高血压程度和寒冷持续时间的影响。适当的人工寒潮和自然寒潮的作用相仿，可以在RHR基础上建立模拟临床发病的脑卒中动物模型。 第二部分人工寒潮对RHR心脑阻力血管收缩反应性的影响 目的：前面的动物实验发现ACE导致SD的SBP升高，但使RHR的SBP明显下降。本实验通过检测RHRSP和SD大脑中动脉(MCA)和冠状动脉左前降支(CA)对于受体依赖的(phe，U46619，ET-1)和非受体依赖的(highK+)血管收缩剂的离体张力反应差异来分析ACE对其血管反应性的不同影响及其可能的机制。方法将2k2c法复制成功的RHR(SBP＞200mmHg)及正常血压的SD大鼠分为寒潮和非寒潮共4组(6只/组)，单笼放置于寒冷和室温3天后，显微操作分离MCA和CA制作离体动脉环，等张收缩法测定离体血管张力及其对于血管收缩剂的反应。结果1.人工寒潮显著地减弱SD大鼠phe，U46619，ET-1和highK+诱导的MCA血管收缩反应；2.与SD相比，以上血管收缩反应在RHR都显著低于SD；3.与室温组相比，人工寒潮对于RHR的MCA血管收缩反应没有显著改变；4.对于SD和RHR大鼠来说，ACE都没有明显改变phe，U46619，ET-1andhighK+所引起的冠状动脉血管收缩反应；5.对于SD和RHR大鼠来说，人工寒潮不影响Ach引起的血管内皮依赖的冠状动脉的舒张反应；6.相对于SD来说，人工寒潮所引起RHR冠状动脉内皮细胞依赖的收缩反应显著增加。结论RHR的MCA血管收缩反应能力显著低于SD，而且在寒冷时丧失了进一步减弱收缩的调节保护能力；RHR的冠状动脉和大脑中动脉的血管反应性有所不同，提示严重高血压的RHR主要损害脑动脉，是研究高血压性脑动脉硬化和脑卒中的良好模型。 第三部分人工寒潮对RHR外周血白细胞基因表达谱的影响 目的：本实验利用基因芯片技术检测ACE对于RHR外周血白细胞的基因表达变化谱的影响。方法复制RHR经历ACE处理前后尾静脉取血提取白细胞总RNA，经过荧光标记后与5705条基因的oligoDNA芯片杂交、扫描，ACE处理前后样本对照，数据分析筛选出差异表达的基因。结果本实验RHR外周血白细胞基因在5705条基因中共表达4165条。达到显著差异标准表达(ratio≤0.5或者≥2)的基因共61条(P＜0.01)，其中上调18，下调43个。上调最明显的是Ca2+激活的K+通道(Kcnn4)3.2倍，其次是免疫球蛋白B(Igb)和(Sc4mol)，下调最明显的是转铁蛋白受体(Tfrc)3.6倍。其中转运、转录调控，细胞运动和凋亡相关基因组下调；上调的是细胞免疫相关的Cd3d；运输，信号，代谢，发育和分化组有双向改变。 结论利用cDNA芯片技术我们初步发现人工寒潮对于RHR外周血白细胞基因表达谱的影响主要是抑制蛋白降解、跨膜转运和免疫反应，同时，ACE也有可能通过抑制RHR大鼠血管内膜新生、糖皮质激素分泌和凝血功能而与卒中前状态相关。 第四部分人工寒潮和高血压对大鼠脑组织蛋白表达谱的影响 目的：本实验利用双向电泳技术检测人工寒潮对RHR额叶脑组织的蛋白表达谱的影响，并通过质谱分析的方法进行表达差异蛋白的初步鉴定，以了解寒冷及高血压对于大鼠脑组织功能的影响。方法提取SD、RHR以及ACE处理后的RHR额叶脑组织蛋白进行双向电泳，凝胶成像后用PDQuest软件分析其蛋白表达谱，并挑取有显著差异的96个点进行质谱分析。结果高血压和人工寒潮都能对大鼠脑组织蛋白表达谱产生影响，质谱分析成功率84％，高血压对脑组织蛋白表达的影响主要与结构蛋白、神经组织增生、氧化应激和凝血功能有关，寒冷对于高血压大鼠脑组织的影响主要是影响结构蛋白的合成。结论RHR大鼠在长期的高血压过程中已经出现了神经系统和凝血功能的变化，对脑卒中的防治有启示价值。 第五部分RHR脑梗死早期基因表达变化及其意义 目的：利用基因芯片研究肾性高血压大鼠(RHR)脑梗死早期梗塞边缘区域基因表达谱的改变及其意义。方法双肾双夹法复制RHR模型和线栓法复制持续的大脑中动脉闭塞(pMCAO)模型，设置假手术组为对照，术后12小时取梗塞边缘区域脑组织，提取RNA，经过荧光标记后与5705条基因的oligoDNA芯片杂交、扫描，并与对照组进行比较，数据分析筛选出差异表达的基因。结果表达4165条，差异表达129条，其中表达上调93个，下降36个。转录调控、逆境反应、细胞粘附和细胞凋亡组全部上调。运输、信号、分化、发育、代谢、细胞周期组双向变化。结论脑梗死后早期缺血区功能基因明显变化，提示与脑梗死的某些可能有关分子机制和的治疗靶点。