论文部分内容阅读
背景：间充质干细胞(MSC)在机体内环境因子的影响下,可能并不能有效发挥免疫调节功能,反而成为具有致炎作用的细胞。目前关于MSC在自身免疫病类风湿关节炎(RA)中的作用报道不一。瓜氨酸化纤维蛋白原(cfb)是RA患者体内存在的一种重要的自身抗原。近年来,研究证实cfb可以作为Toll样受体(TLR)的内源性配体即损伤相关分子模式(DAMP)参与RA的发病。MSC表达多种功能性的TLR,但是cfb是否可以作为MSC的DAMP,从而影响MSC的致炎作用和免疫调节功能,目前尚未见到相关报道。目的：本研究旨在探讨RA中特异的自身抗原cfb对骨髓MSC (BMSC)的致炎作用和免疫调节功能的影响,并探究其中相关的分子机制；进一步通过体内实验深入阐明cfb对BMSC的影响及其在关节炎发病中的作用。此外,本研究还以脐带MSC (UC-MSC)作为观察对象,观察cfb对这群细胞致炎作用和免疫调节功能的影响。方法：酶联免疫吸附法(ELISA)检测RA患者与健康对照者血清中抗cfb抗体的水平,将RA患者血清中的抗cfb抗体水平与患者的关节炎活动评分(DAS28)或血清中致炎性细胞因子水平进行相关性分析,进一步明确cfb在RA发病过程中的病理意义。从RA患者及其对照骨关节炎(OA)患者的关节置换术中取得骨髓,分离培养BMSC。观察cfb刺激对RA或者OA的BMSC细胞功能的影响,以未修饰的纤维蛋白原(fb)刺激作为对照组、未刺激的BMSC作为空白对照组。用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)与ELISA分别检测各组致炎性细胞因子(IL-6、IL-8、CCL2、IL-1 β与TNFα)的基因及蛋白水平。PCR与流式细胞术(FCM)检测不同处理组细胞TLR4的基因及蛋白表达水平。免疫印迹法(WB)检BMSC中NFκB信号通路相关蛋白的表达水平,并在抗原刺激实验中加入TLR4中和抗体或NFκB信号通路的抑制剂,明确TLR4-NFκB信号通路是否参与cfb诱导的致炎作用。观察cfb是否影响BMSC的免疫调节功能,采用cfb预处理的BMSC与外周血单个核细胞(PBMC)共培养,FCM检测淋巴细胞增殖与活化情况；将不同处理组的BMSC与Th17细胞分化体系共培养,观察cfb是否干扰BMSC对Th17细胞的抑制作用。PCR检测各组BMSC中免疫调节分子Jagged1、转化生长因子β1(TGF-β1)与吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)的表达。牛Ⅱ型胶原(CⅡ)免疫注射DBA/1小鼠制作胶原诱导关节炎(CIA)小鼠模型,小鼠关节炎发病(免疫注射后第28天)后静脉输注人BMSC (1×106/只)或者cfb预处理的人BMSC(1×106/只),以未处理的模型组作为对照组、未造模的正常小鼠组作为空白对照组。观察各组小鼠关节炎评分,三周后处死小鼠,留取踝关节行HE病理染色。FCM检测各组小鼠脾脏中CD4+T细胞亚群的比例。ELISA检测各组小鼠血清中抗CⅡ抗体和炎性细胞因子水平。结果：RA患者血清中抗cfb抗体水平显著高于健康对照组,而抗fb抗体水平在两组之间并没有显著差异。RA患者的抗cfb抗体水平与DAS28评分、抗CCP抗体水平及致炎性细胞因子(如CCL2)水平均存在正相关性。抗原cfb较fb能够更显著地增加BMSC中致炎性细胞因子IL-6、IL-8与CCL2的mRNA及蛋白水平,但cfb与fb两者均不影响BMSC中IL-1β与TNFα的表达。然而,抗原cfb诱导OA与RA两种不同来源BMSC的致炎效应并没有显著不同。抗原cfb处理不影响BMSC中TLR4的表达,但是cfb可以活化下游NFKB信号通路相关蛋白如p-p65与p-IKBα。阻断实验证实cfb是通过TLR4-NFκB信号通路的介导促使BMSC产生致炎性细胞因子IL-6、IL-8与CCL2。此外,抗原cfb明显减弱BMSC的免疫调节功能包括对PBMC增殖、活化的调节作用及对Th17细胞分化的抑制效应；cfb不影响BMSC表达Jagged1与TGF-β1,但可以明显干扰BMSC表达免疫调节分子IDO,并且亦可能是通过TLR4的介导。在CIA体内,与未处理的BMSC相比,cfb预处理的BMSC不能有效下调Th17细胞,对机体内炎性细胞因子的调节作用亦减弱。cfb对UC-MSC致炎效应和免疫调节功能的影响并不显著,可能与这群细胞中TLR4的基础表达量低有关。结论：通过体内外实验表明,RA中特异存在的致病抗原cfb促进BMSC的致炎作用并负向调节其免疫抑制功能。cfb可作为RA内环境中的危险信号,影响BMSC功能进而参与RA的炎症反应与疾病进展。本研究同时提示cfb可以不经由传统的抗原提呈途径而是直接作用于机体细胞参与RA的发病。