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猪链球菌病是由猪链球菌引起的猪的多种疾病的总称,属国家规定的二类动物疫病,是一种在世界范围内传播的、人畜共患传染病,临床表现为急性出血性败血症、脑膜炎、心内膜炎、关节炎、孕猪流产、仔猪下痢等,感染特定人群发病,严重可导致死亡,该病给我国乃至全球养猪业造成了巨大的经济损失,严重威胁着公共卫生安全。猪链球菌病病原为S.suis,依据荚膜多糖分型可分为35个血清型(1-34型,1/2型),其中世界范围内流行最广的是猪链球菌2型,1型、7型、9型对猪有较强致病性,临床分离较多。由于血清型众多加之型与型之间毒力和致病性差异较大,且毒力因子及致病机理尚不十分清楚,型间交叉保护力差,这些成为猪链球菌病防治和疫苗研制工作的难题。因此寻找有效且交叉保护性好的保护性抗原有着重要的现实意义。本研究主要包括以下部分：1.猪链球菌安徽分离株血清型、毒力基因分布检测针对2009-2013年安徽地区87株猪链球菌,通过菌落培养生长特征、实验室革兰氏染色镜检,PCR分子生物学分型方法对血清型、毒力基因分布进行检测分析。其中2型猪链球菌24株,1型猪链球菌10株,7型猪链球菌11株,分别占27.6%,11.5%,12.6%的比例,无猪链球菌9型。提示在安徽省猪链球菌2型占有最大比例,为优势菌型。16株2型猪链球菌株中毒力基因型为,mrp+epf+sly+,占2型猪链球菌总数的66.7%。1型菌株HJ25毒力基因型为mrp+epf+sly+,而7型没有该毒力基因型。分离于脑部和关节液中的2型猪链球菌,毒力基因型均为mrp+epfl+sly+,与文献报道中毒力较强的猪链球菌基因型一致,也是目前公认的强毒株所必需的毒力基因表型。2.1型(HJ25)、2型(m1 5)、7型(CZl)毒力检测及致病性研究。选取毒力基因型为]Mrp+epff+sly+的1型、2型猪链球菌HJ25、HJ15,7型猪链球菌株CZ1,寇氏法测定其半数致死量(LDso),2型菌株HJ15毒力最高(LD50值为4.47×107CFU),1型猪链球菌HJ25毒力最低(LDso值为1.41×109CFU),三株菌同时攻毒小白鼠,通过病理切片观察其致病性。三种不同型的猪链球菌造成的主要病变特征表现在肺脏组织,提示猪链球菌主要感染呼吸系统,致死机理有可能与猪链球菌侵袭肺脏等多器官,造成小叶性肺炎,导致小鼠呼吸困难,从而引起死亡有关。3.猪链球菌分泌性蛋白RfeA基因的克隆、表达及免疫保护性研究。参照GenBank登陆的猪链球菌2型菌株05ZYH33的RfeA基因序列,设计合成一对特异性引物,经PCR扩增1型,2型、7型猪链球菌RfeA全基因,扩增结果显示,7型猪链球菌未扩增到目的基因,将目的基因克隆至pET-32a原核表达载体,构建重组表达质粒pET-32a-RfeA,转化到大肠杆菌BL21中诱导表达RfeA蛋白,经SDS-PAGE电泳可见大小约为38kD的目的蛋白。免疫印迹显示重组蛋白有免疫活性,目的蛋白纯化后加弗氏佐剂乳化,分别于第1天、第14天、第21天免疫小鼠并用间接ELISA方法检测免疫前、免疫后不同免疫期小鼠血液中IgG抗体水平和细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-2含量,结果显示一免、二免、三免后IgG抗体水平升高,二免后效价达到1-097075200,IFN-γ、1L-4、IL-10、JL-2含量均有升高,且在二免后与对照组相比有显著升高。三免后一周用1型、2型、7型猪链球菌以绝对致死剂量对RfeA重组蛋白免疫组及对照组的小鼠进行腹腔攻毒,结果显示,RfeA重组蛋白对1型保护力100%,2型保护力80%,7型保护力仅为20%,说明RfeA重组蛋白只能对含有该基因的猪链球菌具有一定的保护性,而对不含有该基因的猪链球菌几乎没有保护率,其交叉保护性差。