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固醇调节元件结合蛋白(sterol-regulatory element binding proteins,SREBPs)是一类关键的转录因子,它们通过与下游基因启动子中的甾醇调控元件序列(SRE)结合,直接激活30多个基因的转录,在脂代谢信号网络中起着重要的调控作用。SREBP有3种同型异构体:SREBP-1a、SREBP-1c和SREBP-2。最近研究证明,脂代谢信号转导通路在肿瘤的发生与发展中发挥着十分重要的作用。因此,研究在脂代谢信号网络中起着重要作用的SREBP分子的转录调控,对于探索与其相关代谢性疾病的分子机制及治疗药物筛选的研究具有重要意义。CRISPR/Cas9系统是继锌指核酸酶(zinc-finger nucleases,ZFNs)和转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs)技术之后的一种新的高效靶向基因组定点编辑技术。由于其设计简单、效率高、耗时短,被广泛应用于基因功能的研究。为了研究SREBP基因的转录调控,我们利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术,分别在HEK293和HepG2细胞的SREBP基因的3’端定点整合入T2A-Luciferase报告基因,建立了插入荧光素酶报告基因的HEK293和HepG2细胞系,并利用PCR结果证实了细胞系中荧光素酶报告基因在基因组上的定点整合。为了证明所建立的T2A-Luciferase-KI细胞系的可靠性和敏感性,我们利用CRISPR/dCas9技术构建了高效的转录激活/抑制系统,并使用该系统对所建立的T2A-Luciferase-KI细胞系中SREBP基因的转录调控进行了测试。将Cas9蛋白两个位点进行突变(H840A和D10A位点),从而获得无切割活性而只有结合DNA能力的dCas9(dead Cas9),然后进一步将dCas9与VP64激活因子或Kruppel associated box(KRAB)抑制因子结构域融合获得相应的转录激活/抑制系统。该系统在靶向目的基因启动子区域的sgRNA(single guide RNA,sgRNA)引导下,可以对靶基因实施转录激活或抑制调控。此外,我们利用已经证实可以调节SREBP基因表达的转录因子和药物对所建立的细胞系的功能进行进一步的验证。结果表明所构建的T2A-Luciferase-KI细胞系中的荧光素酶的表达水平可以反映内源性SREBP基因表达变化。这种新的细胞系将成为研究SREBP基因转录调控的有用工具,同时在筛选调控SREBP基因表达的药物或化学小分子方面具有很大的潜力。本课题的研究内容如下:(1)靶向SREBP1&2基因终止密码子下游区域sgRNA的设计及活性筛选。通过NCBI查询得到人SREBP1&2基因组序列,选择SREBP1&2的基因组终止密码子3’端下游作为靶向区域,通过序列分析在该区域分别筛选出4个高特异性的sgRNA结合位点。并构建了相对应的sgRNA表达载体,经细胞转染及T7E1 assay方法检测,获得了具有较高生物学切割活性的sgRNA,为后续的细胞系建立奠定了基础。(2)靶向SREBP1&2基因供体载体的构建。设计并成功构建了在基因组SREBP1&2基因C端定点插入报告基因荧光素酶的供体载体。该供体载体上下游同源臂之间包含有正筛选元件eGFP和Neomycin,同源臂外侧包含有负筛选元件mCherry和TK。在供体载体中同时携带正负筛选表达元件,不仅可以通过报告基因的区别直观地区分出同源重组细胞与随机整合细胞,而且可以通过自杀基因(TK)对随机整合的细胞进行剔除以及通过Neo筛选基因对同源重组细胞进行富集,有效地提高了同源重组细胞比例。(3)SREBP1/SREBP2-T2A-luciferase-KI HEK293 及 SREBP1/SREBP2-T2A-luciferase-KI HepG2细胞系的建立。药物筛选后的细胞通过有限稀释法克隆化的方法获得单个细胞克隆,然后通过PCR及测序验证了荧光素酶报告基因在靶基因位点发生了正确重组,最终获得的单一稳定的阳性克隆命名为SREBP1/SREBP2-T2A-luciferase-KI HEK293 及 SREBP1/SREBP2-T2A-luciferase-KI HepG2 细胞系。(4)靶向SREBP1&2基因启动子区的sgRNA表达载体的构建。根据文献确定了SREBP基因的启动子区域,并依据sgRNA的设计原理分别在其启动子区域设计了 8个sgRNA识别靶位点,合成对应引物后,分别变性退火与sgRNA表达载体连接并测序,最终获得SREBP1&2 promoter sgRNA1-8表达载体。构建的这些sgRNA表达载体为实现SREBP基因的转录调控提供了可能。(5)SREBP1/SREBP2-T2A-luciferase-KI HEK293 及 SREBP1/SREBP2-T2A-luciferase-KI HepG2细胞系的体外实验研究。将dCas9与VP64及KRAB融合构建转录激活/抑制系统。然后把该转录激活/抑制系统、影响SREBP基因表达的相关转录因子以及影响SREBP基因表达的相关药物用于所构建细胞系中靶基因转录调控的研究。研究结果表明,所构建细胞系中荧光素酶的表达变化能够真实地反映靶基因SREBP的相对表达量及表达变化。综上所述,本课题利用CRISPR/Cas9基因编辑技术首次在基因组水平上将T2A-Luciferase报告基因定点整合入SREBP1&2基因3’端,分别建立了 SREBP1/SREBP2-T2A-luciferase-KI HEK293 及 SREBP1/SREBP2-T2A-luciferase-KI HepG2四种Knock-in细胞系,并验证了外源基因在这些细胞系的基因组中定点整合。同时利用CRISPR/dCas9技术介导的转录调控系统、相关转录因子和药物分别对SREBP1/SREBP2-T2A-luciferase-KI HEK293 及 SREBP1/SREBP2-T2A-luciferase-KI HepG2细胞系中SREBP基因转录水平进行了研究。结果表明,SREBP1/SREBP2-T2A-luciferase-KI HEK293 及 SREBP1/SREBP2-T2A-luciferase-KI HepG2细胞系内的荧光素酶的表达水平可以灵敏准确地反映出细胞内SREBP分子的表达水平。这种新的细胞系将成为研究SREBP基因转录调控的有用工具,为研究SREBP基因参与的分子机制以及筛选可以影响其表达的药物提供了一种新的方法。同时,在靶基因的下游定点整合报告基因来检测靶基因表达状况的方法可以广泛地应用于对其他靶基因的研究中。