心搏骤停(CA)导致极高的致死、致残率，已成为威胁人类健康的重要因素。近年来随着急救网络完善，急救技术进步，心搏骤停患者恢复自主循环的机会增加，但绝大多数自主循环恢复(ROSC)的患者却随后因脑功能损害而死亡或残留神经系统后遗症。如何有效地实施脑复苏治疗挽救缺血神经元，促进受损神经组织修复以尽可能维持正常的神经功能已成为心肺复苏的重点，也是目前急救医学面临的难题。长期以来，脑复苏药物治疗的研究进展不大，低温治疗虽具有一定的脑保护作用，但难以逆转已形成的神经损害，因而有待新的治疗措施出现以提高脑复苏的治疗效率。　　 干细胞移植是近几年兴起的治疗手段，在此前脑梗塞的实验研究中，以骨髓间充质干细胞(MSCs)为主的干细胞治疗取得了令人瞩目的进展，研究表明MSCs移植后减轻了局灶性缺血导致的神经元损伤，减少了梗死面积，并促进了神经功能恢复，提示MSCs移植可能在脑复苏治疗中具有一定的应用前景。目前尚未有干细胞移植应用于脑复苏治疗的研究报道，而全脑缺血损害发病机制、缺血损伤范围、性质都有别于局灶性脑梗死，因此MSCs移植后如何在脑组织内分布和分化，是否能减轻全脑缺血损伤尚不得而知。　　 本研究探讨MSCs移植对心搏骤停后全脑缺血损伤的治疗作用以探索新的脑复苏治疗途径。主要内容包括:建立大鼠MSCs培养和扩增方法，体外验证MSCs向神经元样细胞分化的能力；建立大鼠脑复苏模型；增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记MSCs，观察EGFP-MSCs移植对全脑缺血损伤的治疗作用以及移植细胞在脑内分布和分化情况；进一步利用磁共振成像(MRI)技术活体示踪移植的MSCs。　　 第一部分大鼠骨髓间充质干细胞体外培养及向神经元样细胞分化的研究　　 研究目的:建立大鼠骨髓MSCs的体外培养方法，研究MSCs的生物学特性。验证MSCs在体外向神经元样细胞分化的能力。为MSCs移植在脑复苏治疗中应用的研究提供实验和理论基础。　　 材料和方法:细胞培养健康4～5周龄Sprague-Dawley(SD)大鼠，无菌条件下抽取骨髓，用贴壁培养法分离骨髓MSCs，在37℃、50％CO2、饱和湿度的条件下，以含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基培养，24h半量换液，3d全量换液。7～9天细胞铺满瓶底后第一次传代，此后在细胞生长至约90％融合时进行传代。　　 MSCs生物学特性培养过程中观察细胞形态，以MTT法测定细胞生长曲线，流式细胞仪检测细胞周期和细胞表面抗原CD45、CD11b、CD29、CD44表达情况。　　 诱导MSCs向神经元样细胞分化以丹参和β-巯基乙醇(β-ME)进行诱导，选择生长状态良好的第3代的MSCs，按2x105/孔密度接种6孔板，加入丹参和β-ME预诱导液培育24h，更换培养液，PBS洗涤3次，分别加入丹参和β-ME诱导液诱导5h。观察诱导后细胞形态变化，采用RT-PCR和免疫荧光技术检测星形胶质细胞酸性蛋白(GFAP)和微管相关蛋白-2(MAP-2)的mRNA和蛋白表达情况。　　 结论:　　 1.建立了MSCs原代培养和体外扩增的实验方法；　　 2.MSCs取材方便，增殖活性高，体外培养易于扩增、纯化，符合干细胞移植研究的需要；　　 3.β-巯基乙醇和丹参等诱导剂可在体外诱导MSCs分化为神经元样细胞。　　 第二部分大鼠心搏骤停和复苏装置研发和脑复苏模型的建立　　 研究目的:研发大鼠心搏骤停和复苏装置(包括电刺激致颤器和机械复苏装置)，掌握利用该装置建立标准复苏模型的技术参数和实验条件；研究建立脑复苏模型的合适缺血时间；探讨MR检测在评价全脑缺血损伤中的应用价值。　　 材料和方法:心搏骤停和复苏装置研发和复苏模型研究研发用于大鼠交流电致颤器和机械复苏装置。选用SD雄性大鼠20只，应用研发的心搏骤停和复苏机械装置，持续交流电经右心室内膜致颤。在6min心室颤动后，开始给予6min的机械胸外按压和同步机械通气，随后双向波经胸体外除颤。　　 脑复苏模型合适缺血时间的研究实验分组:(1)对照组，进行手术操作，不致颤和复苏；(2)VF6组，无处理室颤6min，复苏6min；(3)VF8组，无处理室颤8min，复苏6min；(3)VF10组，无处理室颤10min，复苏6min；实验组大鼠在ROSC后1d、3d、7d、14d分别进行脑组织病理以及含水量检测和NSS神经功能评分。对照组在手术完成后24h进行上述检测和评分。　　 MR评价全脑缺血损伤的研究实验组于ROSC后上述时间点再次麻醉动物进行MR检测。对照组3只大鼠在完成手术操作后3d进行MR检测。MR检测序列包括SET1WI、T2WI，T1WI:TR350ms，TE18ms，T2WI:TR1600ms，TE80ms，矩阵256×256，层厚2mm，视野7cm×7cm，线圈11cm。　　 结论:　　 1.研制成功大鼠交流电致颤器和机械心肺复苏装置。该装置符合心肺脑复苏实　　 验研究的要求；　　 2.CPP维持在25mmHg左右是复苏成功的条件；　　 3.未处理室颤8min和心肺复苏6min是较为合适的脑复苏模型缺血时间；　　 4.心搏骤停后全脑缺血损伤具有部位选择性和延后性特点；　　 5.MR检查可以应用于评价全脑缺血损伤。　　 第三部分MsCs移植应用于脑复苏治疗的研究　　 研究目的:研究通过腺病毒载体(Ad5F35)转导外源基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)体外标记MSCs的有效性和安全性；以大鼠脑复苏模型为研究对象，通过颈动脉移植EGFP-MSCs，观察EGFP-MSCs是否进入全脑缺血损伤脑组织，能否分化为神经细胞；通过病理组织检测、脑组织含水量测定和神经功能评分评价MSCs移植对全脑缺血损伤的治疗作用。　　 材料和方法:EGFP体外标记MSCs通过腺病毒载体Ad5F35将EGFP基因转染MSCs，以流式细胞仪和荧光显微镜观察评价不同条件下的转染率；观察转染后EGFP-MSCs的细胞活力、凋亡率、细胞周期以及向神经元样细胞分化能力。　　 MSCs移植治疗全脑缺血损伤的研究(1)分组设计:按前述方法建立大鼠脑复苏模型，大鼠经历8分钟无处理室颤和6分钟心肺复苏，ROSC后进行右颈动脉置管，将大鼠随机分为两组:PBS组和:EGFP-MSCs组，分别于ROSC后2h由右颈动脉输入5×106EGFP-MSCs或0.5mlPBS每组纳入实验动物数为24只。(2)治疗作用评价:在大鼠自主循环恢复后1d、3d、7d、14d以NSS评分评价大鼠神经功能，并进行脑组织病理和含水量检测。　　 MSCs移植后在脑组织分布和分化情况制备脑组织冰冻切片，荧光显微镜下观察荧光细胞分布情况，同时采用免疫荧光检测MAP-2、GFAP表达情况。　　 结论:　　 1.通过腺病毒载体Ad5F35转染EGFP，可以高效、稳定、安全地标记MSCs；　　 2.MSCs移植可进入全脑缺血损伤脑组织内，并部分分化为神经元和神经胶质细胞；　　 3.MSCs移植可减轻全脑缺血脑组织损伤，改善神经功能，促进脑组织水肿消退。　　 第四部分MSCs菲立磁标记及MR活体示踪的研究　　 研究目的:研究通过硫酸鱼精蛋白为载体将菲立磁转入MSCs，对MSCs进行磁性标记的可行性和安全性；在脑复苏模型中探讨以MR活体示踪移植的磁性标记MSCs的可行性；以MR活体示踪技术研究MSCs移植后在全脑缺血损伤脑内分布和迁移规律。　　 材料和方法:菲立磁标记 MSCs的体外实验(1)以硫酸鱼精蛋白为载体将10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL不同剂量菲立磁转入MSCs，以电镜检查和普鲁士蓝染色进行标记后鉴定和标记率分析；(2)对磁性标记后的MSCs作MR体外成像研究；(3)观察磁性标记对MSCs细胞形态、增殖活性、凋亡率影响。　　 磁标记MSCs移植后MR活体示踪的研究(1)分组设计:假手术组(n=3)在手术操作完成后不进行心搏骤停和心肺复苏，手术操作完成后4h经右颈动脉输入5×106磁性(FE-PRO)标记MSCs；大鼠.ROSC后随机分为两组:FE-PRO标记MSCs组和单纯MSCs组，分别在大鼠ROSC后2h经右颈动脉输入5×106鱼精蛋白-菲立磁(FE-PRO)标记MSCs或未标记MSCs。(2):MR检测:在输入细胞后1d、3d、7d、14d再次麻醉大鼠进行MR检测，各时间点各3只动物。检测部位包括脑、肝脏、脾脏、股骨骨髓腔，检测序列均为SET1WI，SET2WI。(3)组织普鲁士蓝染色在各时间点进行完MR检测后，取脑、肝脏、脾脏、肺脏多聚甲醛固定，石腊包埋，切片，普鲁士蓝染色30min，随后核固红对比染色。　　 结论:　　 1.FE-PRO可高效、安全地对MSCs进行磁性标记；　　 2.通过FE-PRO标记和MR检测可活体示踪移植的MSCs；　　 3.MSCs全身移植后主要分布于肝脏、脾脏、肺脏等部位；　　 4.全脑缺血损伤时，MSCs可通过血脑屏障，并选择性分布于缺血损伤严重的海马和颞叶皮层部位。