痘苗病毒天坛株作为疫苗，在我国消灭天花的历史上居功至伟。近年来，痘苗病毒天坛株作为活病毒载体在预防艾滋病、狂犬病和流感等传染病方面取得了巨大成就。然而，颅内接种实验表明，痘苗病毒天坛株对小鼠的致死率较高，具有一定的神经毒性。临床接种痘苗病毒天坛株疫苗也可能导致少数接种者出现严重副作用，例如脑炎、结膜炎、心肌炎及全身性发痘等。因此，如何构建更加低毒、更加安全且高效的痘苗病毒天坛株疫苗或载体成为研究的热点。通过同源重组和Cre-LoxP技术，定点敲除痘苗病毒基因组中的复制非必需基因，是构建减毒疫苗或载体的有效方法。基因重组作为基因工程的重要技术之一，包括同源重组、位点特异性重组以及转座重组。同源重组技术，又叫基因打靶技术，是目前研究痘苗病毒基因功能、构建减毒型痘苗病毒疫苗和载体的主要方法。该技术通过构建含有左右重组臂、启动子和筛选标记基因的穿梭载体，使病毒基因组与外源DNA序列发生重组，进而定点修饰或缺失基因组上某一目的基因，构建缺失型痘苗病毒。进而，通过体外和体内实验对缺失型痘苗病毒的生长动力学、病毒粒子表型、细胞间传播能力、毒力、宿主范围和免疫原性等特性进行系统分析。在构建缺失型毒株的过程中，通常需要引入筛选标记基因，用于病毒筛选。然而，筛选标记基因作为外源基因的存在不符合商业疫苗生物安全的要求，在研究过程中需要将其删除。Cre-LoxP系统作为一种特异性重组技术，能够定点将外源基因删除，广泛用于重组病毒、细菌和转基因动物等的研究。Cre重组酶能够特异性的识别LoxP位点（两个反向重复序列）和其间的间隔区域。当两个同向LoxP序列位于同一条DNA链上，Cre重组酶能有效切除位于两个LoxP序列之间的序列。本研究基于传统痘苗病毒天坛株，分别构建了缺失TC7L-TK2L基因（15,262~25,450）和TA35R基因（138,881~139,570）的弱毒株vMVTT1、vMVTT2和vMVTT3。其中，TC7L-TK2L基因包括TC7L、TC6L、TC5L、TC4L、TC3L、TC2L、TC1L、TN1L、TN2L、TM1L、TM2L、TK1L和TK2L共13个片段。vMVTT1缺失了TC7L-TK2L基因，vMVTT2缺失了TA35R基因，vMVTT3同时缺失了TC7L-TK2L和TA35R基因。通过体内和体外实验对缺失型病毒的生长动力学、细胞间传播能力、病毒表型、毒力下降水平、宿主范围以及免疫原性进行了分析。首先，在BHK-21、Vero、MDCK、HeLa和PK15五种细胞中，通过结晶紫染色实验和MTT实验等多种方法分析了缺失型毒株（vMVTT1、vMVTT2和vMVTT3）和野生型VTT在细胞间传播能力、复制能力、病毒表型及细胞毒性和宿主范围之间的差异，并对缺失毒株的遗传稳定性进行了评估。然后，通过鼻内和颅内感染途径分别用vMVTT1、vMVTT2、vMVTT3和野生型VTT感染小鼠，通过统计小鼠体重下降程度和死亡情况分析缺失TC7L-TK2L基因和TA35R基因后天坛株痘苗病毒毒力下降水平；用缺失型毒株通过皮内途径感染家兔，观察家兔接种部位病灶变化大小和程度，进一步分析缺失型毒株对皮肤的损伤程度及其毒力下降水平。最后，分别用vMVTT1、vMVTT2、vMVTT3和野生型VTT接种BALB/c小鼠，检测血清中IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ的含量和特异性抗体水平，并进行攻毒保护实验，分析小鼠的免疫水平，进而评价vMVTT1、vMVTT2和vMVTT3的免疫原性。结果表明，通过同源重组和Cre-LoxP系统，成功构建了缺失TC7L-TK2L基因和TA35R基因且不含外源基因的减毒痘苗病毒天坛株vMVTT1、vMVTT2和vMVTT3，均具有良好的遗传稳定性。电镜结果表明缺失TC7L-TK2L基因和TA35R基因不影响天坛株病毒粒子的形态发生。但是，对其生长动力学、细胞间传播能力、毒力和免疫原性有较大影响。与野毒相比较，vMVTT1、vMVTT2和vMVTT3在PK15、Vero、HeLa、MDCK和BHK-21细胞中的复制能力均下降，复制能力由大到小依次为VTT> vMVTT2> vMVTT1> vMVTT3。细胞与细胞间传播能力依次为VTT>vMVTT2>vMVTT1>vMVTT3，其中vMVTT3仅在BHK-21细胞上有一定的传播能力，在Vero、HeLa、MDCK和PK15细胞中传播能力较弱。MTT实验表明缺失型毒株对5种细胞的杀伤能力依次为VTT>vMVTT2> vMVTT1>vMVTT3。家兔皮肤致病力实验表明，VTT组对兔皮的损伤最大，毒性最强，vMVTT3组对兔皮基本无损伤，毒性最弱。而vMVTT1组和vMVTT2组对家兔皮肤均有致病力，且vMVTT2皮肤致病力较强。另外，痘斑形成的大小与感染缺失型病毒的滴度也有较大关系。通过鼻内和颅内接种途径感染小鼠，结果表明接种途径对病毒毒力的评估有较大影响。鼻内接种途径实验表明vMVTT1、vMVTT2和vMVTT3毒力明显下降，其中vMVTT3毒力下降约100倍。而颅内接种实验表明vMVTT2毒力下降80倍，vMVTT1和vMVTT3毒力下降3200倍。另外，细胞因子检测和中和试验结果表明缺失TC7L-TK2L基因和TA35R基因对天坛株痘苗病毒的免疫原性几乎没有影响，接种小鼠后没有显著降低其免疫应答水平，仍可诱导产生较高水平的IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ，并可刺激小鼠体内产生高水平中和抗体。攻毒保护试验结果表明vMVTT1、vMVTT2和vMVTT3作为疫苗对小鼠具有较好的保护作用，用高剂量（500×LD50）的野生型VTT攻击小鼠也没有出现死亡。综上所述，本研究所构建的三个缺失型毒株的毒力均有不同程度的下降，其中vMVTT3毒力下降最为明显且保持了较好的免疫原性，具有作为疫苗或载体的潜能。本实验基于VTT，在不引进外源标记基因的条件下，同时缺失TC7L-TK2L和TA35R两段基因，并成功获得毒力下降且免疫原性较好的缺失型痘苗病毒天坛株，具备作为疫苗或载体的潜能，在各种传染性疾病的防治等领域具有较好的应用前景。