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铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,PA）是一种革兰氏阴性条件性致病菌,广泛存在于各种自然环境——包括土壤、水、植物、动物,以及日常生活和临床等环境。由于其具有复杂多样的营养和代谢系统,因此与急性和慢性感染相关。无论是在自然界中还是在宿主中,铜绿假单胞菌都持续面对复杂的环境挑战,因而进化形成了精密的信号转导系统——双组分调节系统（Two-component regulatory system,TCS）来调节其对外界的应答反应,协调对环境变化做出的适应性反应。双组分调节系统是原核细胞的主要信号转导方式,使细菌能够感知胞外信号,从而调节相关基因的表达,在细菌对不同环境的适应过程中发挥重要的调节作用。然而,铜绿假单胞菌中诸多的未知双组分调节系统是否与皮肤伤口感染相关,以及双组分调节系统如何发挥其致病功能从而促进感染的机制仍然知之甚少。本研究基于实验室前期研究结果,分析了铜绿假单胞菌PA14的转座子突变文库的高通量测序（Tn-seq）结果,进一步筛选了铜绿假单胞菌在皮肤伤口感染过程中与其致病性相关的双组分调节系统,最终得到显著影响皮肤伤口感染的四个未知的双组分调节系统基因,分别是PA1449420、PA1445870、PA1464570和PA1432570（已命名为nioS,并已完成了初步的致病机制研究）,并对其在铜绿假单胞菌皮肤伤口感染过程中的功能机制进行了进一步的研究。为了研究PA1449420、PA1445870、PA1464570这三个双组分调节系统基因在皮肤伤口感染过程中具体的功能机制,实验首先构建完成这三个双组分调节系统的基因敲除菌株。利用基因敲除菌株进行了小鼠皮肤伤口感染实验,结果发现三株基因敲除株感染皮肤伤口的能力显著受损,表明这三个双组分调节系统在铜绿假单胞菌皮肤伤口感染中起着重要作用,同时也验证了Tn-seq结果的正确性。为了研究这三个双组分调节系统是如何促进铜绿假单胞菌皮肤伤口感染的,我们对这三株基因敲除菌株进行了RNA-seq分析。RNA-seq结果表明PA1445870调节包括群体感应、细菌趋化性和分泌系统等在内的毒力因子基因的表达;PA1449420调节包括亚钼蝶呤和分泌系统等在内的毒力因子基因的表达;PA1464570调节包括铁吸收、群体感应以及分泌系统等在内的毒力因子基因的表达。上述结果说明,PA1445870,PA1449420和PA1464570可以通过调节铜绿假单胞菌的毒力基因表达来促进铜绿假单胞菌皮肤伤口感染,提高致病性。前期实验结果表明双组分调节系统NioSR调节反硝化系统相关的基因比较显著,其中在反硝化系统中发挥重要作用的一氧化氮还原酶基因norCBD受到NioSR调节最明显,本文进一步深入研究NioSR调节反硝化系统基因norCBD促进皮肤伤口感染的功能机制。qPCR检测结果发现不管是好氧还是厌氧培养条件下,△nioSR菌株中一氧化氮还原酶亚基基因norC的表达显著下调。同时,体外一氧化氮杀菌实验结果表明,△nioS、△nioR和△nioSR抵抗一氧化氮杀伤的能力与野生株相比显著下降,表明NioSR能够通过调节一氧化氮还原酶基因norC的表达来降解一氧化氮,从而抵抗一氧化氮杀伤。小鼠皮肤伤口感染实验表明△norCBD菌株感染小鼠皮肤伤口的能力显著下调,表明norCBD基因在促进皮肤伤口的感染过程中起着重要作用。综上所述,NioSR能够通过调节一氧化氮还原酶基因norCBD来降解一氧化氮,以抵抗一氧化氮杀伤,从而促进其在皮肤伤口中的感染。为了确定NioSR是否与已知的反硝化通路相关的调节子存在相互作用关系,我们分别构建了在PA14野生株背景下和△nioSR菌株背景下anr,dnr,atvR,narXL基因敲除菌株。随后对不同基因敲除株在厌氧条件下不同基因的转录表达水平进行检测,结果表明ANR处于最上级,可以激活DNR和NarXL的表达,但会抑制AtvR的表达,DNR与NarXL略有相互调节作用,上述结果与文献报道一致。另外,结果表明NioSR能够抑制AtvR和NarL的表达,但对ANR和DNR的表达均没有影响,同时ANR,DNR,AtvR和NarXL对NioSR的表达也均没有影响,上述结果表明NioSR是不受已知反硝化系统调节子调控的新型反硝化调节系统。综上所述,本课题证明了铜绿假单胞菌的三个新型双组分调节系统通过调控下游毒力因子的表达来促进皮肤伤口感染,并进一步阐明NioSR在皮肤伤口中通过调节一氧化氮还原酶基因norCBD,促进铜绿假单胞菌降解免疫毒性分子一氧化氮以增强皮肤伤口感染的机制,为解决临床烧伤和皮肤伤口感染提供了新的理论基础和治疗思路。