研究背景:大量研究已证实激素性股骨头坏死（osteonecrosis of the femoral head,ONFH）的发生和发展与骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）密切相关。大剂量糖皮质激素（glucocorticoids,GCs）能够诱导BMSCs凋亡,并改变其分化方向,最终导致ONFH。单酰基甘油脂酶（monoacylglycerollipase,MAGL）作为体内大麻素系统中的重要节点之一,能调控多种组织细胞的氧化应激损伤和增殖分化。由此我们提出MAGL也能通过调控BMSCs的氧化应激和凋亡,改变其分化方向,从而预防早期激素性ONFH的假说。本研究围绕该假说作了以下研究:第一部分:单酰基甘油脂酶（MAGL）在调控大剂量糖皮质激素（GCs）诱导的BMSCs氧化应激和凋亡中的作用和机制研究目的:评估大剂量GCs对BMSCs的影响,以及MAGL在BMSCs中的表达变化,明确MAGL和激素性ONFH的相关性。深入探讨GCs诱导的氧化应激和凋亡的关系,并评估调控MAGL是否能保护BMSCs免受GCs诱导的氧化应激和凋亡的影响,以及潜在的分子机制。方法:从SD大鼠（4周龄）四肢长骨提取原代BMSCs,传代培养至3-6代。在进行GCs诱导BMSCs氧化应激和凋亡的体外实验中,为了观察甲强龙琥珀酸钠（methylprednisolone sodium succinate,MP）对 BMSCs 的影响,用含有不同浓度梯度的MP（10-6mol/L-10-4mol/L）的α-MEM孵育BMSCs。通过CCK8细胞增殖毒性实验,Western blotting,ROS染色,TUNEL染色,细胞免疫荧光染色评估细胞氧化应激水平、凋亡水平。为了进一步了解MP诱导的氧化应激和凋亡之间是否有直接关系,我们在用MP（10-4mol/L）处理BMSCs的同时,加入NADPH氧化同工酶（NADPH oxidation isoenzyme,NOX）抑制剂（DPI（10-4mol/L）或 VAS2870（10-4mol/L））进行干预,并与MP组的BMSCs进行对比。通过Western blotting,ROS染色等一系列的体外实验,比较各组细胞的氧化应激相关指标的表达情况、ROS水平、凋亡相关指标的表达情况,以及凋亡细胞数量。另外,我们通过Western blotting,免疫荧光染色验证在不同浓度梯度的MP干预下,BMSCs中MAGL的表达情况。进一步测试MAGL是否参与调控MP干预下的BMSCs的氧化应激和凋亡。采用MAGL的抑制剂MJN110（10-6mol/L）,MAGL过表达质粒,MAGL慢病毒提前干预孵育BMSCs,然后再用MP（10-4mol/L）处理细胞,分别与仅采用MP（10-4mol/L）干预组进行对比,通过Western blotting、ROS染色和TUNEL染色等一系列的体外实验,比较各组细胞的氧化应激水平,凋亡水平,以及相关蛋白的表达情况。Nrf2通路是体内氧化应激的关键通路,通过Western blotting和免疫荧光分析比较不同干预条件下Nrf2信号通路中的相关蛋白（Nrf2,Keap1,HO1和NQO1）在BMSCs中表达变化。再用Nrf2激动剂或Nrf2过表达质粒转染干预细胞,比较不同组别细胞的氧化应激相关指标的表达情况、氧化应激水平、凋亡相关指标的表达情况和凋亡水平。最后再敲除Nrf2或用Nrf2抑制剂干预细胞,观察阻断Nrf2是否会逆转MJN110对GCs诱导的BSMCs氧化应激和凋亡的治疗效果。用LPS和MP交替注射建立SD大鼠激素性ONFH模型,用注射等量DMSO的SD大鼠作为对照组,同时建立MJN110治疗组（在模型组大鼠的基础上,用MJN110进行干预（10mg/kg/天,腹腔注射））。通过Micro-CT分析,HE染色,TUNEL染色分析各组股骨头的形态学变化和骨组织内BMSCs凋亡水平。通过提取大鼠四肢骨组织蛋白Western blotting分析以及免疫组化染色,分析GCs对骨组织中氧化应激相关蛋白、凋亡相关蛋白、Nrf2信号通路相关蛋白和MAGL表达的影响。结果一:CCK8实验结果显示,高浓度的MP对BMSCs具有细胞毒性,会显著抑制BMSCs的增殖。随着MP的浓度升高,ROS染色和TUNEL染色阳性的BMSCs细胞逐渐增多,这提示细胞的氧化应激水平和凋亡水平在MP的干预下显著上升。Western blotting也证实了氧化应激相关蛋白NOX1,NOX2,NOX4的表达水平会随着MP浓度的增加或干预时间的延长而升高,而Cleaved-Casp3,Cleaved-Casp9和BAX等凋亡相关蛋白的表达呈现出与氧化应激相关蛋白相同的升高趋势。与对照组相比,模型组的股骨头内观察到的骨小梁密度显著下降,骨参数指标也反应了相同的趋势。通过组织蛋白提取物的Western blotting检测,模型组的氧化应激相关蛋白和凋亡相关蛋白表达显著上升。体内实验同样显示模型组的股骨头内TUNEL染色阳性的BMSCs显著多于对照组。结果二:体外Western blotting实验结果证实了在NOX抑制剂（DPI（10-4mol/L）或VAS2870（10-4mol/L））干预后,BMSCs中氧化应激相关蛋白NOX1,NOX2,NOX4的表达水平与MP组相比显著下降,并且Cleaved-Casp3,Cleaved-Casp9和BAX等凋亡相关蛋白的表达呈现出与氧化应激相关蛋白相同的下降趋势。ROS染色和TUNEL染色结果进一步证实了,在NOX抑制剂的干预下,BMSCs细胞内的氧化应激水平和凋亡水平同步下降。同时还发现MAGL的表达也会随着MP干预而上升。结果三:Western blotting结果显示MJN110或shMAGL显著抑制MAGL的表达,在MAGL抑制剂处理组中,在GCs诱导下高表达的NOX家族蛋白以及凋亡相关蛋白被抑制。在MJN110干预或shMAGL转染后,细胞内ROS水平明显下降。此外,TUNEL实验结果证实,MAGL阻断后,凋亡的BMSCs数量减少。同时检测的MAGL过表达对BMSCs的氧化应激水平和细胞凋亡的调控也正如预期的那样,MAGL过表达进一步增加了 MP诱导的BMSCs氧化应激和凋亡水平。结果四:Western blotting实验和细胞免疫荧光实验证实在MP的干预下,Nrf2、HO1和NQO1的表达显著减少,而Keap1的表达增加。与之形成对照的是,在MJN110的干预下Nrf2,HO1和NQO1的表达显著增加,而Keap1的表达下降。同时,MJN110能够逆转MP对Nrf2通路相关蛋白表达变化的影响。在进一步的实验中显示Nrf2激动剂的加入或者Nrf2的过表达不仅能降低氧化应激相关蛋白的表达水平,而且凋亡相关蛋白的表达也在Nrf2激活后受到抑制。ROS染色和TUNEL染色结果也证实,随着Nrf2信号通路的激活,BMSCs的氧化应激水平和凋亡水平显著下降。而使用Nrf2的抑制剂ML385干预BMSCs或者直接使用siRNA敲除Nrf2能够逆转抑制MAGL对BMSCs的有利影响,在ML385或siNrf2的干预下,BMSCs中氧化应激相关蛋白和凋亡相关蛋白的表达水平再次上升。ROS染色和TUNEL染色结果也证实了,随着Nrf2通路的阻断,BMSCs氧化应激水平和凋亡水平显著回升。结果五:H＆E染色结果表明MJN110预防性给药显著减少了股骨头内固缩核和空骨陷窝的数量。CT分析结果进一步证实MJN110不仅增加了骨体积（BV）、骨小梁相对体积（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）,还降低了骨小梁分离度（Tb.Sp）。TUNEL实验结果显示,治疗组的凋亡细胞比模型组少。此外,通过Western blotting和免疫组化染色,同时证实了 MAGL抑制通过Nrf2通路负调控GCs诱导的氧化应激反应和细胞凋亡。结论:1.大剂量GCs会诱导BMSCs氧化应激和凋亡水平增加,抑制GCs诱导的氧化应激能够减少BMSCs的凋亡水平。2.MAGL的表达升高和GCs的干预密切相关。3.MAGL抑制通过减轻氧化应激来有效改善GCs诱导的BMSCs凋亡。4.MAGL抑制对BMSCs的保护机制是通过Nrf2信号通路介导实现的。第二部分:调控MAGL对在糖皮质激素干预下的BMSCs分化方向的影响目的:通过体外实验研究调控MAGL是否能保护BMSCs免受GCs对其产生的促进成脂分化、抑制成骨分化的影响,并探讨可能的分子机制。通过体内实验观察调控MAGL是否能够通过改变BMSCs分化方向从而减轻股骨头坏死。方法:从SD大鼠（4周龄）长骨干中提取的3-6代的BMSCs细胞被用于进行体外实验。用CCK8测试DEX对BMSCs的细胞毒性。为了验证地塞米松（dexamethasone,DEX）对于BMSCs分化以及MAGL表达的影响。我们在进行GCs干预BMSCs成骨或成脂分化体外实验中,在不同浓度梯度的DEX（5*10-8mol/L-10-6mol/L）的成骨或成脂分化培养基孵育BMSCs。通过Western blotting,RT-PCR,ALP染色,ALP活性检测,茜素红S染色,油红O染色及细胞免疫荧光染色检测BMSCs成骨分化水平、成脂分化水平、成骨或成脂分化相关指标和MAGL的表达。下一步,将条件培养基中加入MAGL的抑制剂MJN110（10-6mol/L）),通过Western blotting,RT-PCR,ALP染色,ALP活性检测,茜素红S染色,油红O染色等一系列实验,分析抑制MAGL对于BMSCs分化的调控作用。再用MAGL过表达质粒转染BMSCs,观察MAGL过表达对BMSCs分化方向的影响。接着,用MAGL的抑制剂MJN110（10-6mol/L）和DEX共同干预BMSCs,与DEX组的BMSCs进行对比,分析MAGL的抑制剂是否能够逆转DEX对于BMSCs分化的影响。再用MAGL在体内的主要水解物2-花生四烯酸甘油（2-arachidonoyl-glycerol,2-AG）和DEX共同干预BMSCs,与只进行DEX干预的BMSCs进行对比,重复上述实验,再次验证MAGL对BMSCs分化方向的调控作用。为了确定MAGL调控BMSCs分化的目标下游受体,分别采用大麻素受体1型（cannabinoidreceptor 1,CB1）和大麻素受体 2 型（cannabinoidreceptor2,CB2）抑制剂,或者相应的 siRNA 阻断 CB1 和 CB2,通过 Western blotting,RT-PCR,ALP染色,ALP活性检测,茜素红S染色,油红O染色,检测BMSCs成骨分化水平和成脂分化水平。PI3K信号通路在细胞分化过程中扮演重要角色,因此通过Western blotting分析比较不同干预条件下PI3K信号通路中的相关蛋白（AKT,p-AKT,GSK3β,p-GSK3β）在BMSCs中表达变化,然后采用CB2抑制剂干预细胞,观察其是否能逆转MJN110对PI3K信号通路相关蛋白的调控作用,最后再将不同浓度的PI3K抑制剂LY294002加入含有DEX和MJN110的培养基中,通过Western blotting,ALP染色,ALP活性检测,油红O染色,观察LY294002是否能逆转MJN110对BMSCs的治疗效果。通过LPS和MP交替注射建立SD大鼠激素性ONFH模型,用注射等量DMSO的SD大鼠作为对照组,并建立MJN110治疗组（在模型组大鼠的基础上,用MJN110进行干预（10mg/kg/天,腹腔注射））。通过Micro-CT分析,H＆E染色,分析各组股骨头的形态学变化以及组织内成骨水平和脂肪含量。通过组织免疫荧光实验,分析在MAGL抑制后,股骨头内成骨和成脂相关指标表达的情况。用TRAP染色实验检测各组股骨头内破骨细胞的数量。然后通过体外细胞TRAP染色实验检测MAGL抑制对破骨细胞形成的影响。最后通过Western blotting和免疫组化染色,验证MAGL是否调控BMSCs内RANKL和OPG的表达变化,从而明确MAGL在激素性股骨头坏死模型中对于骨吸收的调控作用机制。结果一:CCK8结果显示,当DEX浓度大于10-6mol/L时,对BMSCs具有细胞毒性。ALP染色显示,DEX干预的浓度越高ALP阳性的细胞越少,ALP的活性越低,茜素红染色也表明钙结节的数量和DEX的干预浓度负相关。与之相反的是细胞内的脂肪滴数量会随着DEX的干预浓度上升而升高。Western blotting和RT-PCR实验进一步证实了成骨分化相关指标ALP,RUNX2和OCN的表达水平会随着DEX干预浓度的增加而减少,而成脂分化相关指标PPARγ,CEBPβ和LPL的表达呈现出与成骨分化相关指标相反的趋势。同时发现MAGL的表达也会随着DEX干预浓度的增高而上升。另外,组织免疫荧光和细胞免疫荧光也证实了上述成骨相关指标、成脂相关指标和MAGL的表达变化相关。结果二:Western blotting和PCR分析结果显示,与DMSO处理组的BMSCs相比,MJN110干预组的BMSCs成骨标志物的表达水平显著升高,而成脂标志物的表达水平受到显著抑制。另外,MJN110干预组的ALP染色阳性细胞增多、ALP活性更强、钙结节增多、脂肪滴减少。用MAGL过表达质粒转染BMSCs,取得了和MJN110干预相反的结果。Western blotting和RT-PCR结果显示,与DEX组相比,在DEX+MJN110处理组中的BMSCs成骨相关蛋白表达增加,同时ALP染色阳性细胞也显著增多,ALP活性变强,钙结节数量增加。与之相反的是,MJN110处理后的BMSCs成脂指标的表达水平明显降低,产生的脂肪滴数量显著减少。而另一个体外实验显示,2-AG的干预起到了和MJN110相似的治疗效果。Micro-CT图像结果显示,在MJN110干预下,股骨头软骨下骨小梁得到有效修复,并在股骨头内有序排列。与模型组比较,MJN110组BV、BV/TV、Tb.Th值显著升高,而Tb.Sp值显著降低。H＆E染色显示,在MJN110处理后,骨骺变宽,骨形成增加,脂滴减少。免疫荧光染色也证明了,MAGL抑制通过逆转GCs对BMSCs分化的影响,增强骨形成,从而部分改善激素性股骨头坏死。结果三:使用siRNA和相应的抑制剂来降低CB1和CB2的表达后,PCR分析显示,在单独干预时,CB1抑制剂处理或siCB1转染可增强BMSCs成骨分化,但减弱成脂分化,而CB2的阻断则呈现相反的结果。当MJN110和CB1的阻断同时干预BMSCs时,则出现叠加的治疗作用,成骨分化更强,而成脂分化进一步减弱。当MAGL和CB2的阻断同时进行时,CB2的阻断可逆转MJN110的治疗效果。结果四:首先,通过Western blot分析证实在DEX处理组中PI3K通路相关蛋白表达被抑制（p-AKT和p-GSK3β）。在BMSCs条件培养基中加入MJN110后,可以激活PI3K信号通路。MJN110对DEX所抑制的PI3K/AKT通路的激活作用可被CB2抑制剂AM630逆转。其次,使用LY294002抑制BMSCs中PI3K的表达,Western blotting结果显示它可以部分逆转MAGL抑制所致的成脂标志物表达降低,且呈剂量依赖性。相反,随着LY294002浓度的增加,成骨标志物的表达水平呈下降趋势。同时在含有MJN110和DEX的培养基中加入LY294002后,ALP阳性细胞明显减少,ALP活性下降,脂肪滴数量明显增加,证实了 MAGL抑制是通过激活PI3K/AKT/p-GSK3 β信号通路调控BMSCs分化。结果五:通过组织TRAP染色发现MJN110治疗减少了股骨头中的破骨细胞数量。体外TRAP实验也证实了,与DEX组相比,MJN110的干预确实能减少破骨细胞的数量。进一步检测结果表明,DEX可显著降低OPG的表达,升高RANKL的表达,并直接导致了 RANKL/OPG 比率的增加。免疫组化染色结果也证实模型组股骨头RANKL表达升高,采用MJN110的治疗可逆转这一趋势。结果表明在GCs诱导的ONFH模型中,MAGL的阻断通过直接减少破骨细胞和降低BMSCs中RANKL表达两个途径来改善GCs导致的骨吸收增加。结论:1.抑制MAGL不仅可以增强BMSCs成骨分化、抑制成脂肪分化,还可以通过激活CB2有效逆转GCs对BMSCs分化的影响,2.PI3K/AKT/GSK3β信号通路介导了 MAGL对BMSCs分化的调控作用。3.MAGL阻断不仅能促进骨形成,还能减弱GCs诱导的骨吸收增强。