MicroRNA是一类非蛋白编码的小RNA分子,由于其对于基因表达过程中的关键调控从而可以作为疾病检测的标志物。随着基础生物学研究的不断发展和疾病早期诊断的需要,miRNA表达水平的精确定量分析变得越来越重要。恒温指数扩增(Isothermal Exponential Amplification Reaction,IEXPAR)技术由于操作简便、反应时间短,高灵敏度、高特异性等特点已经广泛用以检测mRNA、细胞、蛋白质、小分子甚至是离子,进一步讲特别适用于检测序列短小的单链miRNA。尽管拥有众多优势,但传统IEXPAR扩增反应本身存在的瓶颈问题主要是:序列依赖性以及非特异性扩增等,这些问题极大限制了 IEXPAR扩增反应检测miRNA的灵敏度、特异性。为解决这一问题,我们通过摸索,发现在传统IEXPAR模板3’粘性末端添加Poly(dT)10尾巴以及对3’末端封闭修饰(巯基基团修饰)就可以有效改善序列依赖性问题;同时引入单链结合蛋白(SSB),可以进一步抑制空白,提高灵敏度。该模板修饰策略结合SSB对多种miRNA的灵敏检测均起到了很好的作用。研究结果也为进一步解决传统IEXPAR扩增反应瓶颈问题提供一个重要的思路。另一方面,检测miRNA的恒温扩增方法包括高效的IEXPAR扩增方法大多数都是基于动物miRNA作为引物直接引发核酸聚合延伸反应,大量研究结果已经表明植物miRNA与动物miRNA在结构上存在较大的差异,植物miRNA中3’末端2’-O-甲基化修饰。这种3’末端-碱基2’-O-甲基化严重抑制了以目标分子植物miRNA作为引物在聚合酶催化作用下沿核酸模板的聚合延伸反应。因此,传统IEXPAR等高效恒温扩增反应无法用于目标分子植物miRNA的直接扩增及检测,为解决IEXPAR在植物miRNA检测方面存在的固有不足,我们报道了一种新型的,简单的,高灵敏度的检测植物miRNA的方法。此方法主要是将DNA三通(Three-Way Junction,3WJ)结构和扩增效率极高的恒温指数扩增IEXPAR结合(3WJ-IEXPAR)。在该方法中,根据目标分子miRNA合理设计两条3WJ探针,分别是3WJ引物和3WJ模板,在无目标分子miRNA存在时二者在溶液中独立存在不产生杂交和后续扩增反应,当引入目标分子miRNA时,miRNA分别与3WJ引物和3WJ模板的部分序列互补三者形成稳定的3WJ结构,进而3WJ引物延伸且生成小引物继而引发高效IEXPAR扩增。该方法通过靶标介导的3WJ结构的形成,使得后续IEXPAR无需miRNA直接引发,而转变为对一段已知优良IEXPAR引物序列的高效扩增,在克服了植物miRNA无法直接引发IEXPAR这一关键问题的同时,也在一定程度上有效避免了 IEXPAR的序列依赖性。该方法对于植物ath-miRNA156a的检测灵敏度高,选择性良好,并成功用于植物拟南芥中Total RNA含量的准确定量分析。