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目的:骨关节炎(OA)微环境以基质金属蛋白酶-13(MMP-13)过表达和弱酸性为特征,使开发双响应性诊治纳米探针用于OA诊断和治疗成为可能。然而,目前的MMP/pH响应系统生物相容性差,并且响应探针不具有软骨靶向性,不适合OA并且尚未应用于OA。本课题设计了一种新型的软骨靶向和MMP-13/pH双响应铁蛋白纳米笼(CMFn),其装载有抗炎药物(羟氯喹,HCQ),称为CMFn@HCQ,用于OA成像和治疗。方法:实验分为三部分。第一部分:CMFn@HCQ的合成和性质研究。首先将铁蛋白纳米笼(Fn)表面修饰软骨靶向肽(WRYGRL),然后将cy5.5标记的MMP-13可切割肽(MMP-cy5.5)和CFn缀合,将其与BHQ-3标记的CFn(CFn-BHQ)通过调节pH形成杂合铁蛋白(CMFn),最后调节pH装载药物HCQ形成CMFn@HCQ纳米载药系统。进行材料的表征:使用动态光散射分析仪(DLS)进行粒径和材料稳定性分析,透射电子显微镜(TEM)分析纯化的CMFn的形态,凝胶电泳(SDS-PAGE)分析分子量大小,全波长酶标仪分析紫外吸收光谱,荧光分光光度计分析荧光光谱和CMFn的荧光恢复,高效液相(HPLC)检测载药量和HCQ的累计释放量。第二部分:CMFn@HCQ纳米载药系统的体外靶向性、MMP-13/pH双响应和抗炎活性的研究。实验组分为五组:(1)空白对照组;(2)IL-1β组;(3)IL-1β+HCQ组;(4)IL-1β+MFn@HCQ 组;(5)IL-1β+CMFn@HCQ 组。C57BL6/J乳鼠的软骨细胞经过处理和培养后进行后续细胞实验。使用CCK-8法检测CMFn对软骨细胞的毒性作用。细胞用IL-1β诱导1天后,使用细胞摄取和Col2al免疫荧光染色进行CMFn的靶向性和酶响应性研究。软骨细胞用IL-1β分别诱导1、3、5天后,使用细胞摄取实验进行CMFn的酶响应性的研究。最后,分别使用RT-qPCR(MMP-13,IL-6,MMP-3和Col2al的基因表达)、苏木精-伊红(HE)染色、MMP-13和IL-6免疫荧光染色检测CMFn对体外细胞的抗炎活性。第三部分:CMFn@HCQ纳米载药系统的靶向性、MMP-13/pH响应和药效学的研究。小动物活体成像系统被用来检测纳米笼在各个时间点对MMP-13的响应情况。使用高效液相(HPLC)检测各个时间点小鼠关节腔内药物的滞留情况,验证CMFn在体内的靶向性。分别在治疗14天和42天后取材,进行大体观评分。样本固定后切片,进行HE、番红O-固绿、MMP-13免疫组化染色和组织学评分,验证CMFn的体内药效学。结果:成功合成CMFn@HCQ纳米载药系统,并进行材料表征。CMFn纳米笼粒径约为22nm,结构为类球形、大小均一、颗粒分散性好,分子量约为25kDa。材料稳定性良好,体积集中范围约在22nm之间。紫外吸收光谱证实了 cy5.5和BHQ-3的特征峰,荧光光谱显示CMFn荧光强度比CFn明显减少,证明CMFn成功构建。CMFn的荧光恢复实验验证MMP-13刺激CMFn的荧光激活,并监测CMFn随着时间变化荧光强度的改变。CMFn@HCQ的载药量为49%。体外释放实验结果表明在pH=7.4的条件下,CMFn@HCQ中HCQ的累积释放量仅为36%,在pH=5.0时累积释放量为59%,在pH=5.0并加入MMP-13后,HCQ的累积释放量达到83%,证明CMFn@HCQ是MMP-13/pH响应系统。CMFn对软骨细胞具有良好的抗炎活性。CCK-8的结果显示CMFn纳米笼在0至120μg/mL的剂量下没有表现出细胞毒性。细胞摄取实验表明CMFn成功靶向软骨细胞产生的II型胶原部位,并且随着MMP-13的浓度增加,CMFn中的荧光强度逐渐增加,表明CMFn在细胞中的酶响应性能。RT-qPCR结果显示CMFn@HCQ和细胞孵育l天后,炎症因子标志物的基因表达下调为55-60%,Col2al的表达上调77%。HE和免疫荧光染色结果表明CMFn@HCQ纳米笼在IL-1β存在下能维持软骨细胞的表型,并能抑制IL-1β诱导的炎症因子MMP-13和IL-6的表达。小动物活体成像仪显示CMFn在OA关节腔具有强荧光,而在正常关节具有弱荧光,说明荧光强度随着OA的严重程度的增加程正相关,并且CMFn的荧光滞留时间比MFn长,该结果验证了 CMFn在关节腔内的靶向性和MMP-13响应的性能。HPLC结果显示在各个时间点CMFn@HCQ中的HCQ浓度比HCQ和MFn@HCQ大,结果验证了 CMFn在关节腔内的靶向性能。验证CMFn对OA小鼠的治疗效果。对各组的关节进行拍照观察、评分,最后进行组织学染色和组织学评分,结果均显示CMFn@HCQ的治疗效果最好。结论:总之,我们已经成功设计了一种新型多功能复合物纳米药物递送系统,该系统既具有MMP-13/pH双刺激响应功能,也具备软骨靶向功能,可以根据需要预测治疗剂量并在关节腔内释放。该系统的设计用于响应OA关节微环境的两种独特化学信号。一种是过表达的MMP-13可以让该系统能够实现NIR染料的MMP-13响应,使荧光信号恢复,并用于荧光成像和OA的诊断。另一种是酸性微环境可以让OA治疗系统的抗炎药物进行pH响应并释放。因此,该系统有希望应用于临床的OA诊断和精准治疗。