研究背景与目的 淋巴瘤在组织和细胞形态学方面与高度反应增生性淋巴组织的鉴别诊断十分困难，容易造成误诊。淋巴瘤病理诊断是临床病理工作的难题之一。目前国内主要依靠以形态学为主、免疫组化为辅的诊断手段。随着分子生物学的发展，从基因水平研究和分析诊断疾病的技术不断出现并且日趋成熟，为淋巴瘤诊断提供了有效工具。淋巴瘤是由单克隆淋巴细胞增生所致，而反应增生性淋巴组织则来自于多克隆淋巴细胞，这是二者的重要区别。编码免疫球蛋白(Ig)或T细胞受体(TCR)的基因经过重排以后，不同克隆之间的重排基因互不相同，因此，基因重排对淋巴瘤的诊断具有特异性价值。以PCR技术为基础的方法以其简便、高效、廉价及适用面广而在淋巴瘤基因重排研究方面越来越受重视。但不同研究文献中所采用的引物、PCR条件、PCR产物检测方法等都不尽相同，结果也有差异。因此，难以找到适于常规临床病理诊断之用的标准程序。Jurkat细胞是T细胞淋巴瘤基因重排研究中常用的阳性对照细胞，但有关Jurkat细胞基因重排的详细情况也未见报道。假基因是Ig和TCR胚系DNA中常见的基因，有关假基因参与重排的情况以及在设计引物方面是否应将假基因包括在内也未见有关研究报道。本实验以TCR基因重排为研究对象，通过优化引物选择、PCR条件及PCR产物的检测方法等，分析T细胞淋巴瘤基因重排检测的最佳方法。同时，分析TCR基因重排的特点，为进一步研究TCR基因重排提供理论和技术支持。 方法 1 以TCR_γ基因重排为研究对象，选用通用引物TVG、V_γⅠ及TCR_γ家族特异性引物为工具。用正交设计实验优化V_γⅠ引物的PCR条件。另选一对TCRβ通用引物作为TCR_γ引物的补充和比较。 2 利用PCR和测序研究Jurkat细胞基因重排情况，分析TCR基因重排的基本特点。3 PCR产物检测方法①利用TCR通用引物检测淋巴瘤克隆性基因重 排阳性率，分别用琼脂糖电泳和SSCP分析PCR产物;②将PCR产 物分别进行直接测序和克隆后测序，分析TCR基因重排的特点及探 索测序方法在基因重排检测中的应用;③分析PCR产物中DNA的克 隆数与SsCP中条带数目的关系。4将TCR引物按不同形式组合，分析多重引物PCR条件，观察多重引 PCR可以在多大程度上提高T细胞淋巴瘤的阳性检出率。另外分析 TCRp通用引物的PcR条件及在淋巴瘤中的检出率。结果1利用正交设计实验对VYI与反义引物PcR的条件进行优化发现，在 降落式PCR条件下，两条Tm值差别大(分别为72.5℃和51.1℃)的引 物仍可以获得满意的扩增结果。ZJ川火at细胞免疫表型为TCRap阳性、TC助6阴性。但经PCR和测序 发现，该细胞中存在TCRY双等位基因重排〔vs一JI/2和vIV(假基因卜JI/2]。 v8一JI/2扩增产物在连接区插入和删除的碱基数分别为sbp和gbP;v lv(假基因卜Jl/2扩增产物在连接区插入和删除的碱基数分别为23bp和 22bP。358例T细胞淋巴瘤用TCRY通用引物(肠I一J1/2)扩增，PCR产物在 琼脂糖凝胶电泳和SSCP中的阳性病例分别为47和45例，最终阳性率 为77.6%;60例B细胞淋巴瘤用同样的方法检测，在琼脂糖电泳和 SScP中的阳性病例分别为22和6例，最终阳性率为10%;所有在琼 脂糖凝胶电泳中的阴性标本PCR产物在SSCP中全部为阴性。同SSCP 相比，琼脂糖凝胶电泳中总的假阳性率为巧.3%(l 8/1 18);PcR产物 直接测序所得序列不精确，无法判断基因的准确来源;克隆后测序则 可以准确得知重排基本基因的来源，6例PCR产物测序(每份测序 2一4个克隆)中有3例在其中发现有相同序列。TcRY基因重排在连接 区插入和删除的碱基数分别平均为7.2士2.7bP和9.3士5.sbP，v区基 因来源中VS占41.1%(7/17)，V3占29.41%(5/17)，V4占11.8% (2/17)，vs占11.8%(2八7)，v7(假基因)占5.9%(1/17)。在ssep 分析中，单链条带的数目是PCR产物中DNA克隆数的两倍。4降落式PCR条件下，多重引物不影响其中单对引物的扩增效果。采 一2- 用多重引物PCR检测淋巴瘤基因重排，在65例T细胞淋巴瘤中，单 用第I家族的引物检测到的克隆性基因重排阳性率为80.0%，家族特 异性引物检测的阳性率为21.5%，去掉13.8%重复的阳性例数，T细 胞淋巴瘤的总阳性检出率为87.7%;70例B细胞淋巴瘤中Tc助基因 重排的检出率最终为10.0%。降落式PcR用于TcRp通用引物，T细 胞和B细胞淋巴瘤中阳性检出率分别为61.5%和7.1%。TCRp通用引物 扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中未发现假阳性。结论1正交设计实验可用于PCR条件的优化;退火温度差别大的引物在降 落式PCR条件下仍可获得良好扩增效果。ZJ切火at细胞基因重排与细胞免疫表型不一致，并且为双等位TcRY基 因重排，其中有假基因的重排，家族特异性基因重排在连接区碱基数 的变化较第I家族基因重排的明显。3 Tc助通用引物扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中与在sscP分析中相比 有假阳性，但无假阴性，其中的假阳性可以在SSCP分析中排除;PCR 产物直接测序无法用于TC助基因重排的准确分析，但克隆后测序则 准确得知基因重排的相关基?