抗菌肽cgMolluscidin和PaDef的重组表达、纯化及活性研究

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抗菌肽(Antimicrioal peptide)可以通过直接的杀死微生物或者免疫调控来抵抗外界的侵害。而且,可以对多种细菌、真菌起作用而没有产生抗药性的风险,具备替代抗生素的潜力。目前天然抗菌肽的产量非常低,显然无法满足大规模生产的需要。因此,目前迫切的需要找到一种能够高产有活性抗菌肽的方法。本试验采用基因工程的方法来表达外源的抗菌肽,分别采用了两种常见的表达系统,用以大肠杆菌为代表的原核表达系统,来表达一种新型的来源于太平洋牡蛎的大小为55 AA的抗菌肽cgMolluscidin,分别构建了两套重组表达载体pET28a-cgMolluscidin 和 pGEX-cgMolluscidin,经过 IPTG 诱导后目的基因成功表达于上清中,再利用载体上的标签亲和纯化后,测得融合蛋白产量分别为为8.5 g/L和12.1 g/L。将融合蛋白用肠激酶切后得到了无氨基酸残留的目的蛋白cgMolluscidin,用来做抑菌试验,但是没有表现出明显的抑菌活性。采用以毕赤酵母为代表的真核表达系统表达一种来源于鳄梨果实大小为45 AA的抗菌肽PaDef,将抗菌肽基因克隆到pPICZαA载体上,成功构建了分泌型酵母表达载体pPICZαA-PaDef。甲醇诱导后目的基因表达于酵母发酵液上清中,经过Ni亲和纯化后测其产量为158 mg/L。用孔穴扩散法和最小抑菌浓度MIC法检验抑菌活性时,观测到使用毕赤酵母表达系统表达出来的抗菌肽PaDef表现出对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌ATCC 25923、枯草芽孢杆菌151-1以及单增李斯特氏菌ATCC 21633明显的抑菌活性。其中,对金黄色葡萄球菌ATCC 25923的最小抑菌浓度MIC值为19 μg/ml。此实验结果表明,用毕赤酵母表达系统来生产抗菌肽有一定的可行性,为以后抗菌肽实现大规模的工业化生产甚至广泛的应用到食品防腐保鲜、饲料添加、药品、化妆品中提供依据。
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