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花生是重要的油料兼经济作物,真菌病害是花生的主要病害,导致其产量和品质严重下降。单纯依靠常规育种方法很难选育出对真菌病害高抗的品种。而利用遗传转化将外源基因导入花生栽培种则应具有一定的可行性。本研究首先对花生组织培养植株再生方法进行研究,建立了胚小叶高效再生体系,然后利用遗传转化体系,通过农杆菌介导法,将β-1,3-葡聚糖酶基因转入花生品种花育22,以提高花生抗病性。主要研究结果如下:
1.利用8个花生品种对花生组织培养进行研究,结果表明:(1)基因型对再生率有很大影响,不同花生品种的愈伤组织形成和不定芽发生有明显的差异。(2)花生外植体对花生组织培养的植株再生具有很大影响,胚小叶的芽诱导率明显高于子叶、胚轴、胚根等其它外植体。(3)胚小叶的叶龄对不定芽诱导有很大影响,萌发5、6天的种子的胚小叶有利于诱导不定芽的形成,其中萌发6d的胚小叶最高,芽诱导率为91.3%。(4)以花生胚小叶作为外植体用于组织培养离体再生,具有取材简单,来源丰富,再生率高的优点,可将其用于农杆菌介导的基因转化。
(5)不同培养基对不定芽的伸长有很大影响,试验发现,添加4mg/LBAP的培养基,芽伸长比较明显,添加10mg/LBAP的培养基中芽丛生明显。
2.确定了km的选择压,芽诱导培养基中添加km最低浓度为50mg/L可有效抑制非转化愈伤组织的形成或芽再生。添加500mg/LCb可有效抑制农杆菌LBA4404的生长,且对花生外植体的再生无显著影响。
3.对农杆菌介导遗传转化的适宜条件进行研究,结果表明:(1)预培养3天的花生胚小叶外植体最适宜进行基因转化。(2)菌液浓度对转化率影响较大,以OD600=0.4为最好。(3)适宜侵染时间为10-15min,转化率较高。(4)农杆菌共培养时间3d,转化率较高。(5)种子萌发后6d的胚小叶为受体转化效果最好。
4.将β-1,3-葡聚糖酶基因转入花生栽培品种。利用优化的遗传转化体系,以萌发6d的花生品种花育22的胚小叶为外植体,经农杆菌LBA4404侵染,Km筛选和标记基因PCR检测,得到目的基因转化植株。
5.确立了农杆菌介导途径进行花生遗传转化的技术规程:选用花生品种白沙1016或花育22的成熟饱满的种子。经表面消毒后,接种于催芽培养基上,取萌发6d的胚小叶,接种于MSB5+6.0mg/LBAP+1.0mg/LNAA培养基上预培养3d。用活化的农杆菌重悬浮菌液(OD600=0.4)浸染10-15min,共培养3d,经700mg/LCb浸泡冲洗后,转接到MSB5+6.0mg/LBAP+1.0mg/LNAA+50Km+500Cb筛选培养基上继续培养。3w后,将带抗性芽点的愈伤转接到MSB5+10mg/LBAP+50Km+500Cb的再生筛选培养基上诱导丛生芽。2w后将丛生芽转接到MSB5+10mg/LBAP+50Km+500Cb的培养基上促进芽的伸长,每2w继代一次。当芽伸长到3-4cm,转到MSB5+0.5mg/LNAA+50Km+500Cb培养基中诱导生根。