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毕赤酵母表达系统有很多优点,已广泛应用于外源蛋白的表达。但是,毕赤酵母不适于糖蛋白的表达,其表达产物为高甘露糖型,容易在人体中产生免疫反应,限制了毕赤酵母作为宿主菌的使用。a-1,6-甘露糖转移酶(该酶由och1基因编码)的存在是导致高甘露糖形成的重要原因。对该基因的敲除,可有效阻断酵母对糖蛋白的翻译后高甘露糖化修饰,得到的糖蛋白为低甘露糖结构,可规避毕赤酵母高甘露糖修饰弊端,同时为毕赤酵母后续糖基化改造作基础。虽然目前对于毕赤酵母中och1基因敲除有了很多的研究,但是存在问题。och1基因基因敲除效率非常低;对och1基因敲除后的生理特性研究较少。本论文研究发现两步基因重组技术可以高效敲除ura3及och1基因,och1基因的敲除对酵母的细胞壁结构产生很大的影响,并进一步影响其对温度的敏感性。两步基因重组技术可以在高效、定向敲除毕赤酵母目的基因的同时,还可以去除掉筛选标记,为后续改造保留筛选标记,同时没有为待改造菌株引入外源性的抗性类等基因。利用两步基因重组技术成功敲除了毕赤酵母GS115中的ura3基因,该基因编码乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶,此酶在毕赤酵母尿嘧啶合成中起催化作用。GS115被敲除此基因后,突变菌株在尿嘧啶缺陷培养基中不能生长,补充尿嘧啶后生长旺盛,并且可稳定传代,为GS115菌株糖基化改造提供筛选标记,解决该菌株糖基化改造过程中筛选标记不足难题。同时还发现利用该技术可以高效敲除了毕赤酵母JC308中的负责高甘露糖合成的a-1,6-甘露糖转移酶基因(och1),其效率是文献报道的利用双交换同源重组的敲除同样菌株och1基因的20倍。在och1基因的敲除对酵母生理特性影响方面,我们对毕赤酵母X-33 och1敲除株进行了研究,通过刚果红染色、扫描电镜等手段发现och1基因敲除株的细胞壁结构产生很大的影响,其形体较野生型的大,子细胞不易从母细胞完全分离。进一步的细胞活力实验、渗透压实验、生长特征研究等考察,发现其与野生型X-33在生理上有很大差异。och1基因敲除株对温度敏感,生长缓慢,菌体密度低,菌株容易聚集生长,培养过程中死亡率很高等。