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乳脂率是衡量牛乳品质高低的一个关键指标。甘油三酯（Triacylglycerol,TAG）是乳脂中含量最多的组分。TAG由游离脂肪酸（Free fatty fat,FFA）和α-磷酸甘油在酶的催化下合成。这个过程涉及营养物质、转录因子、关键酶以及信号通路的协调调节。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin,mTOR）信号通路在反刍动物乳脂合成过程中起关键调控作用。研究表明短链脂肪酸可以激活牛乳腺上皮细胞中的mTOR分子,通过mTOR信号通路调控乳脂合成,但是具体的分子机制并不明确。为了明确短链脂肪酸激活mTOR信号通路调节乳脂合成的具体方式,本研究以乙酸为诱导物,首先采用浓度梯度的乙酸钠培养奶牛乳腺上皮细胞,通过检测细胞中TAG的含量变化明确诱导奶牛乳腺上皮细胞乳脂合成的最佳乙酸钠浓度为12 mM。Western Blot结果显示12 mM乙酸钠可以提高奶牛乳腺上皮细胞中p-mTOR、p-P70S6K以及p-4E-BP1蛋白的表达（P＜0.01）。采用mTOR抑制剂雷帕霉素处理细胞以及采用基因干扰方法沉默mTOR复合物中的组分RAPTOR后,乙酸钠对mTOR信号通路的激活以及TAG的合成被抑制。这些结果表明乙酸能够通过激活mTOR信号通路促进奶牛乳腺上皮细胞中乳脂的合成。酰基甘油-3-磷酸酰基转移酶6（1-acylglycerol-3-phosphate-O-acyltransferase,AGPAT6）是真核细胞甘油脂类和TAG等物质合成过程中的关键酶。在TAG从头合成途径中,AGPAT6催化溶血磷脂酸（Lysophosphatidic acid,LPA）转化为磷脂酸（Phosphatidic acid,PA）。AGPAT6缺陷的小鼠乳中二酰基甘油和TAG明显减少,提示AGPAT6在催化乳脂合成过程中起重要作用。本研究在添加12 mM乙酸钠的奶牛乳腺上皮细胞中沉默AGPAT6的表达,结果显示细胞中的TAG合成量显著降低（P＜0.01）。而且AGPAT6基因沉默后乙酸钠无法激活mTOR及其下游信号分子的表达,表明AGPAT6介导乙酸对mTOR信号通路的激活和TAG合成。有报道显示AGPAT6催化合成的PA能够与mTOR的FRB结构域特异性结合促使mTOR下游信号分子S6K1及4E-BP1磷酸化,因此本研究推测在乙酸钠-mTOR信号通路中,AGPAT6可能通过合成PA来介导乙酸对mTOR信号通路的激活。本研究在乙酸钠诱导的奶牛乳腺上皮细胞中采用RNAi方法沉默AGPAT6的表达,然后再添加100μM 16:0,18:1PA,Western Blot显示AGPAT6沉默后乙酸钠对mTOR信号通路的激活被抑制,但是添加PA能够重新激活mTOR信号通路。这些结果表明乙酸钠通过AGPAT6产生的PA激活mTOR信号通路,从而促进乳脂合成。为了进一步探究乙酸作用下AGPAT6的表达以及其调节方式,本研究在12 mM乙酸钠处理的奶牛乳腺上皮细胞中研究PPARγ对AGPAT6表达的调节。结果显示PPARγ的激活剂罗格列酮可以显著提高奶牛乳腺上皮细胞中AGPAT6的表达;而采用sh PPARγ降低细胞中PPARγ的表达,AGPAT6的表达显著下降。PPARγ激活可以提高乙酸对TAG合成的诱导作用,当PPARγ激活的同时抑制细胞中AGPAT6的表达,PPARγ对TAG合成的促进作用被抑制。这些结果表明在乙酸钠处理的奶牛乳腺上皮细胞中PPARγ能够正向调控AGPAT6基因的表达,继而促进细胞中乳脂的合成。为了更好地明确PPARγ是否是在乙酸钠的介导下激活AGPAT6的表达,本研究构建包含AGPAT6基因启动子区不同区段的荧光素酶载体,分别将其转染至乙酸钠处理和正常培养的奶牛乳腺上皮细胞。双荧光素酶报告结果显示AGPAT6基因启动子区在-110～40 bp区段的启动活性最强,而且这段启动子区段的启动活性受乙酸钠诱导。通过PROMO数据库发现-110～-40 bp区段存在RXRα的结合位点。RXRα是PPARγ的配体,二者形成二聚体发挥调控作用。本实验在-110～-40区段突变RXRα的结合位点,构建AGPAT6基因启动子区-110～-40突变的荧光素酶载体,并将其转染奶牛乳腺上皮细胞。结果显示RXRα结合位点突变后的AGPAT6的启动活性显著降低,而且不再受乙酸钠诱导（P＜0.01）,表明PPARγ可以通过与RXRα形成二聚体后结合在AGPAT6基因启动子区,调节AGPAT6的转录。染色质免疫共沉淀结果也证明在奶牛乳腺上皮细胞中乙酸钠可以促进PPARγ与AGPAT6的结合。综合以上结果,在奶牛乳腺上皮细胞中乙酸可以通过AGPAT6激活mTOR信号通路,调节乳脂的合成。在乙酸诱导的mTOR激活过程中,PPARγ通过RXRα结合于AGPAT6启动子区,上调AGPAT6的转录活性。本研究结果阐明了短链脂肪酸调节乳脂合成的具体方式,可为乳脂合成的调节研究提供一定的理论支持。