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背景结核病是一种古老的疾病,是目前传染病的头号杀手,严重威胁人类的健康。结核病的诊断和治疗仍是世界性难题,控制及预防结核病的关键是早期快速诊断结核分枝杆菌感染。目前临床上的诊断方法,并不能早期快速诊断出结核病。临床上常用影像学检查和细菌学检查,敏感度较低,且耗时长,结核菌素皮肤试验假阳性率极高。目前建立在细胞免疫基础上的γ干扰素释放实验(IGRA)近年来得到了迅速发展,但是其并不能区分活动性和潜伏性结核病。暂时还没有发现一种结核分枝杆菌抗原对所有结核病人体内的抗体都能检测出来,因此寻找新型的抗原标志物成为国内外研究的热点。目的本研究旨在克隆表达重组蛋白Rv2991,探索其是否具有结核杆菌特异性抗原的性质,并且评价单一抗原Rv2991和复合ESAT-6/CFP-10/Rv3615c在体液免疫和细胞免疫诊断价值,尤其对于菌阴肺结核诊断的应用价值。方法通过TubercuList检索出Rv2991基因序列,以此为模板,用Primer5.0软件设计引物,然后通过分子克隆方法用pET28a与Rv2991获得重组质粒pET28a-Rv2991,转化入BL21(DE3)PlysS感受态细胞进行表达与纯化,得到重组蛋白Rv2991,然后采用Triton X-114相分离法去除内毒素,显色基质鲎试剂法测量内毒素含量,BCA法测量蛋白浓度。ELISA法评价Rv2991在体液免疫诊断中的敏感性和特异性。分别用Rv2991、复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv3615c作为抗原刺激单个核淋巴细胞(PBMCs),ELISPOT检测斑点形成细胞数,评价其在细胞免疫诊断中的价值。结果1.以重组抗原Rv2991、ESAT-6、CFP-10、复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv3615c为刺激抗原,检测肺结核患者和健康体检者血清IgG水平,这四种抗原在结核组的IgG水平均高于健康对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。Rv2991引起肺结核患者血清中IgG抗体的敏感性(24.0%)与CFP-10(26.0%)相当,略低于ESAT-6(32%);Rv2991 IgG抗体的特异性(91.4%)高于ESAT-6(82.9%)和CFP-10(85.7%);复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv3615c引起肺结核患者血清中IgG抗体的敏感性均高于单一抗原。2.Rv2991、ESAT-6、CFP-10、ESAT-6联合CFP-10的敏感性分别为63.2%、73.7%、68.4%、81.6%;特异性分别为93.3%、90.0%、90.0%、86.7%。复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv3615c和ESAT-6、CFP-10检测肺结核病患者、非结核性肺部疾病患者及健康人,对于其中一个抗原,结核菌抗原阳性率在正常对照组、非结核性肺部疾病组2组间比较,差异无统计学意义,而结核病组均高于前2组。复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv3615c的敏感性(87.7%)高于ESAT-6/CFP-10(82.7%)、ESAT-6(76.5%)及CFP-10(74.1%),两两比较差异均无统计学意义(P>0.05);总特异性分别为81.8%(54/66)、84.8%(56/66)、84.8%(56/66)、87.9%(58/66),两两比较差异无统计学意义(P>0.05)。复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv3615c、EAST-6肽段库和CFP-10肽段库在菌阳肺结核组的阳性率依次为94.0%(47/50)、90.0%(45/50)、78.0%(39/50),在菌阴肺结核组的阳性率依次为65%(13/20)、45.0%(9/20)、60.0%(12/20)。结论(1)本研究成功克隆表达重组蛋白Rv2991,去除原核表达所产生的内毒素,并测量去除后内毒素含量符合免疫试验的应用要求。(2)Rv2991有望成为结核病诊断的候选抗原,复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv3615c有较高的敏感性和特异性,尤其对于菌阴肺结核的诊断具有重要的诊断价值。