目的:纳尔逊海湾正呼肠孤病毒（Nelson Bay orthoreoviruses,NBV）最初是40多年前从澳大利亚果蝠中分离出来的,独立形式存在且不与任何疾病发生关联。然而,最近已经证实了有几株NBV是人类呼吸道感染的病原体,并从一些急性呼吸道疾病患者的体内分离出的病原体显示,NBV已经进化为人畜共患病的形式,且可在人类中传播。致病性NBV能引起人类急性呼吸道及肠道炎症,并且在东南亚地区呈逐步漫延的趋势。2007年日本学者TAKAHIRO等首次利用RNA病毒的反向遗传学系统,成功制备出重组NBV-MB,为深入研究NBV致病机理奠定基础。自噬是一种真核细胞为维持细胞自身稳态进行的一种生理性代谢代偿过程。自噬是一种进化保守的细胞自救行为,对维持细胞稳态和应激条件下细胞的存活有重要意义。自噬是真核细胞中进化上保守的过程,降解细胞内底物,参与多种生理过程,并维持细胞稳态。此外,自噬还具有清除感染细胞内细菌和病毒的重要功能。正常情况下,自噬程序处于基础水平状态,但是受到各种胞内和胞外刺激时会被激活。然而,某些病毒显然不受自噬的影响,许多病毒已进化为逃避或利用此机制以各种方式促进其存活和复制。自噬在病毒感染宿主过程中的作用因病毒的不同而不同。据报道自噬能够促进哺乳动物呼肠孤病毒（Mammalian orthoreovirus,MRV）和禽呼肠孤病毒（Avian orthoreovirus,ARV）复制,另有研究发现,猪瘟病毒、轮状病毒（Rotavirus,RV）和丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus,HCV）等几种病毒一方面能够诱导自噬,另一方面自噬也能反过来在病毒生命周期和发病机理中起着重要作用。但是到目前为止,尚无关于NBV感染与细胞自噬的研究报道。由于先前的研究,已知每种病毒能够形成病毒工厂（viral factories,VF,也叫包涵体）的病毒都有一个或两个非结构蛋白是其形成病毒工厂结构所必须的。对MRV和ARV的研究结果表明,光学显微镜下在细胞中单独表达的非结构蛋白μNS形成的VF与感染细胞中形成的VF相似。研究表明,MRV和ARV的病毒非结构蛋白,μNS和σNS在病毒包涵体的形成以及其他复制和组装所需的病毒蛋白和RNA的募集中起着关键作用。基于这些研究,我们知道呼肠孤病毒的复制和重组都是发生在VF中。但目前尚无发表有关NBV的μNS和σNS的报告,μNS和σNS蛋白在NBV复制过程中的具体功能还不清楚。本课题首先根据TAKAHIRO开发的NBV反向遗传技术,通过质粒共转成功获得了NBV重组毒株并进行检测（为了与野生毒株区分将其命名为NBV-MB）,为进一步研究NBV的致病机制提供了材料;并通过研究细胞自噬与病毒感染和复制的关系,揭示自噬在NBV在机体内发病机理中的作用;另外,μNS作为NBV的一种主要非结构蛋白,其作用可能与病毒的包涵体形成有关,而在自噬的研究中发现,μNS蛋白可能与NBV-MB感染细胞而增强细胞自噬的过程有关。因此,本研究进一步研究了σNS与μNS蛋白的表达及其生物学特性。实验结果证实了σNS与μNS蛋白存在相互作用,并且确定了σNS蛋白的结合区域,从而为后续进一步研究呼肠孤病毒的致病机理奠定了基础。研究方法:1.病毒的制备及检测:培养BKH（Baby hamster kidney,BHK）细胞和小鼠成纤维L929细胞,利用反向遗传系统通过将含有10个NBV病毒基因cDNA质粒和可编码T7聚合酶蛋白pcDNA3.1-T7RNAPO1质粒共同转染BKH细胞,来制备重组病毒NBV-MB,并通过L929细胞进行传代扩增;应用病毒空斑检测方法,检测重组病毒的滴度;通过免疫荧光技术、western blotting、病毒RNA垂直电泳几种方法对重组NBV-MB进行检测;2.病毒感染与细胞自噬的研究:重组病毒感染BHK细胞后,利用western blotting检测BHK细胞中自噬相关蛋白LC3-II表达量的方法来评估NBV-MB对自噬的影响;用自噬诱导剂雷帕霉素（Rapamycin,RAPA）、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）及氯喹（Choroquine,CQ）或GFP-LC3质粒转染处理细胞后再感染NBV-MB,检测BHK细胞中LC3基因表达的变化和LC3-II蛋白表达量的变化;在用诱导剂和抑制剂处理BHK细胞后分别用病毒非结构蛋白μNS的质粒pCAG M3和σNS的质粒pCAG S3转染后,通过空斑方法测定病毒滴度的变化,检测自噬诱导剂和抑制剂处理或转染对病毒复制的影响;3.μNS和σNS蛋白生物学特性的研究:培养BHK细胞并分别转染pCAG M3和pCAGS S3质粒,通过免疫荧光法检测μNS和σNS蛋白在细胞内的表达情况;将pCAG M3和pCAGS S3质粒共同转染到BHK细胞后,通过免疫荧光法检测μNS和σNS蛋白在细胞内的表达情况,同时通过western blotting检测μNS和σNS蛋白在感染细胞中的表达;构建σNS的N末端1-60个氨基酸（aa）残基缺失的质粒,测序验证并通过western blotting检测各质粒转染BHK细胞后的蛋白表达情况;通过免疫荧光法检测μNS和σNS蛋白在细胞内共定位的结合区域;最后通过酵母双杂交实验验证μNS和σNS蛋白相互作用的结合区域。结果:1.病毒的制备及检测:成功制备出重组病毒NBV-MB,通过L929细胞扩增传代后其滴度达到108 PFU/ml;免疫荧光法和western blotting检测结果显示,NBV-MB感染的细胞中均有病毒非结构蛋白σNS或μNS的表达;病毒RNA垂直电泳结果显示,与野生毒株相比,NBV-MB的RNA条带分布与数量均一致;2.病毒感染能够促进细胞自噬:NBV-MB感染会诱导宿主细胞自噬,而病毒复制能够促进自噬的发生;μNS蛋白能够促进NBV-MB感染过程中细胞自噬;3.μNS和σNS蛋白存在相互作用:亚细胞定位结果显示NBV的μNS在没有其他病毒蛋白的情况下会形成包涵体结构,而σNS弥散地分布在整个细胞质中;μNS能够通过和σNS蛋白互作在感染细胞的病毒包涵体中共定位;免疫荧光检测及酵母双杂交检测都证实了μNS与σNS蛋白结合的基本区域位于σNS N末端区域的60个aa残基区域内。结论:本课题通过NBV病毒的反向遗传技术,成功制备了具有感染性的重组病毒NBV-MB并且进行检测,使重组病毒能够满足后续实验的要求;实验结果发现NBV-MB感染促进了自噬的发生,而且病毒的复制是诱发自噬的关键;细胞自噬也能够促进NBV复制;病毒非结构蛋白μNS能够促进细胞自噬,μNS和σNS蛋白存在相互作用,σNS能够通过与μNS相互结合而共定位于感染细胞的病毒包涵体中,并确定了互作的σNS结合区域。