凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei，Boone,1931)，又名南美白对虾，属节肢动物门(Arthropodal)、甲壳纲(Crnstacca)、十足目(Decapoda)、游泳亚目(Natantia)、对虾科(Penaeidae)、滨对虾属(Litopenaeus)，是一种广温广盐性的热带海产虾类，具有生长速度快，营养需求低，对养殖环境的适应性强，虾体壳薄、含肉率高、肉味鲜美、经济价值高等优点，是当今世界养殖虾类产量最高的三大品种之一，也是我国对虾养殖区的主要养殖品种。目前，凡纳滨对虾在我国不论是海水，还是淡水养殖都取得了较大的发展，已经成为水产养殖业的热点。但是，随着对虾养殖业的大力发展，养殖面积和规模的不断扩大，流行性病害也日益猖獗。对虾白斑综合症病毒(White spot syndrome virus，WSSV)是导致世界范围内养殖对虾暴发性传染病的病毒，是对全球对虾养殖业危害最大的病原之一。由于WSSV传播迅速，致死率高，危害性大，给对虾养殖业造成了巨大的经济损失。因此，对虾养殖生产上迫切需要对包括白斑病在内的各种疾病的防治对策，而提高对虾的自身免疫力，增强其机体防御机能是综合防治的根本措施之一。 本研究以对WSSV不同抗性的凡纳滨对虾为对象，应用抑制性消减杂交等技术，构建了凡纳滨对虾在WSSV感染前后的差异表达基因消减文库4个，其中2个正向库(在病毒未感染和感染后48h，以抗性家系为Tester，敏感家系为Drivel)和2个反向库(在病毒未感染和感染后48h，以敏感家系为Tester，抗性家系为Drivel)。通过对文库克隆的随机测序和生物信息学分析，所获得的1049条有效ESTs被聚成193个基因簇(cluster)，其中，有132个基因簇包括两个以上的ESTs序列(contig)，61个基因簇为单一序列(singleton)。与NCBI非冗余蛋白质和核酸数据库进行BLAST比对，在获得的序列当中，有62％的序列与 已知的基因序列具有高度的同源性(E value<10<-5>)，其中有532条ESTs在正向库中，118条ESTs在反向库中，而38％则无相似性。根据同源性中已知功能的蛋白基因，将基因簇主要分成9大类：免疫相关的蛋白质和酶，信号调节和转导相关因子，凋亡相关蛋白，抗氧化酶，转运蛋白，核糖体蛋白，转录和翻译相关的因子，代谢相关的因子以及其它。其中，免疫相关的蛋白和酶基因类，其成员最多，占到了总基因簇的一半以上。从中筛选鉴定了40多个差异表达的基因，其中有5个基因片段(1accase，carboxypeptidase B，H<+>-transporting ATP synthase，Acyl-ConAbinding protein(ACBP)， cortical granule protein with LDL-receptor)是在对虾中首次获得，均已递交GenBank登记。此外，血蓝蛋白(haemocyanin)和组织蛋白酶(cathepsin L)ESTs在两个正向库中出现频率最高，分别为274条和54条。 在序列同源性分析中，发现了2个lectin样ESTs序列：一个长400bp具有C-tyPe lectin(CTL结构，另一个长403bp与斑节对虾的lectin PmAV，同源性较高。为了研究这两个片段所在基因的功能，采用RACE技术克隆了这两个凝集素基因的全长cDNA，分别将它们命名为Lvlectin4E(长637bp)和Lvlectin5D(长678bp)。ORF预测和氨基酸序列分析表明，这两个凝集素新基因都是属于C型凝集素，两者均有C-type lectin的糖识别结构域(carbohydrate recognition domain，CRDs)，有保守的半胱氨酸，二硫键和EPN或QPN特征。此外，RT-PCR方法对这两个基因表达情况进行分析发现，Lvlectin4E在肝胰腺、血细胞、鳃、肠、肌肉、脑、盲囊、神经、精管、胃等组织中均有表达，特别在肝胰腺、胃、肠、精管中表达量最高，在眼中可以检测到其微量的表达，但在心脏组织中，则没有检测到。Lvlectin5D在肝、胃中有较高的表达量，在鳃中有很微量的表达，而在其它组织中则没有检测到。 利用基因工程手段，将这两个基因ORF分别插入到表达质粒pQE30中，构建了Lvlectin4E和Lvlectin5D基因重组原核表达载体(pQE30／Lvlectin 4E和pQE30／Lvlectin5D)，并进行转化和诱导表达，经SDS-PAGE和蛋白免疫印迹进行检测分析，发现Lvlectin4E和Lvlectin5D基因的表达产物均分别出现了明显的特异性条带，其融合表达产物的大小与预测的一致，进一步用Ni-NTA亲和层析柱将重组蛋白纯化，获得了高含量高纯度的目的蛋白，再利用分步透析进行了纯化蛋白的成功复性。同时纯化了一个空载pET32a表达的对照蛋白。用重组蛋白作为抗原免疫小白鼠，制备抗融合蛋白的血清，并进一步进行理化分析表明，两个重组蛋白对鱼、兔子、小鼠及鸡等脊椎动物血细胞均具有凝集活性，而且这种凝血活性可被D-果糖、D-半乳糖、乳糖、D-甘露糖和D-葡萄糖和EDTA所抑制；而Ca<‘2+>则对其凝血活性具有促进的作用。两者均能促进PO活性的提高。点杂交结果显示，Lvlectin4E和Lvlectin5D重组蛋白对WSSV表现出特异的亲和力，其中Lvlectin4E比Lvlectin5D的亲和作用更强。 通过在对虾原代细胞和活体实验表明，两个重组蛋白具有一定的抗病毒作用。用WSSV浓度为10<-3>感染凡纳滨对虾原代培养细胞3d后，对照组中被感染细胞有少量死亡，也有少量的碎片出现，而Lvlectin4E重组蛋白与WSSV孵育后感染的仍无细胞死亡，但Lvlectin5D重组蛋白处理组也出现少量死亡；5d后，对照组中感染的细胞大量死亡，细胞碎片堆增大，而Lvlectin4E重组蛋白与WSSV孵育后感染的只有少量细胞死亡，Lvlectin5D重组蛋白处理组也出现较多细胞聚集成堆，部分细胞死亡，但比对照组明显的少，而且出现死亡的时间也相对晚。在对虾活体中进行重组蛋白保护试验结果显示，Lvlectin4E和Lvlectin5D与WSSV孵育后注射对虾均能推迟对虾发病时间，在对照组已发病全部死亡时，处理组还有70％存活，达到显著差异；WSSV感染11天后保护率分别达到57％和43％。但是，先注射WSSV后注射重组蛋白，或先注射重组蛋白后注射WSSV，均与对照组死亡率没有明显的差别。