目的：p100蛋白首先作为EBNA2(Epstein-Barr virus nuclear antigen2, EB病毒细胞核抗原2)的转录调控激活因子被发现。HCA(hydrophobic cluster analysis,疏水簇分析)法发现p100蛋白是由4个重复的SN-like ((Staphylococcal nuclease-like,葡萄球菌核酸酶类似)功能片段和随后位于蛋白C末端的Tudor-SN(TD)功能片段组成。我们通过大量的研究发现p100蛋白作为一种共激活因子参与着基因转录调控,这种作用主要借助其SN样功能片段完成。但p100蛋白TD片段的功能目前并不清楚,但是我们通过比较不同蛋白的结构和功能发现：p100蛋白的TD功能片段与SMN (Survival motor neuron protein,运动神经元生存蛋白)的Turdor功能片段有较高的同源性,具有相似的结构和功能特点。而SMN是一种偶联基因转录调控和pre-mRNA (precusor messenger RNA,前体mRNA)剪接加工的双重功能蛋白,因此我们推测p100蛋白因为具有相似的TD功能片段而具有剪接加工的作用。Pre-mRNA的剪接加工是在一个大的蛋白复合物一剪接体中进行的,而剪接体中重要的组分就是U5snRNP。 hPrp8蛋白和hSnu114蛋白因为能够直接与U5snRNA结合,因而组成U5snRNA的核心。我们研究发现p100蛋白TD功能片段能够与一组U5snRNP特异蛋白组分结合,这其中包括hPrp8蛋白和hSnu114蛋白。但是我们还需要鉴定：(1)它们是直接结合还是通过桥梁蛋白而间接结合?(2)如果是直接结合,它们通过哪一段功能片段结合?基于此,我们开展了相关研究工作。方法：本课题分三部分进行研究,第一部分p100蛋白与hPrp8在细胞内的结合。首先利用GST (Glutathione S transferase,谷胱甘肽S转移酶)融合蛋白钓取法和Western Blot技术研究p100蛋白的TD片段与一组U5snRNP特异蛋白之间的作用。首先提取HeLa细胞的核裂解液,与p100蛋白TD功能片段的GST融合蛋白孵育一定时间后进行SDS-PAGE电泳,使用考马斯亮兰染色或银染分析结果。通过质谱分析p100蛋白TD片段所能结合的核蛋白。在此基础上,利用免疫共沉淀的方法和Western Blot技术研究p100蛋白与hPrp8蛋白在细胞内是否能够稳定结合,提取HeLa-p100稳定表达细胞株的核裂解液,一部分与抗Flag抗体(因为建立p100的稳定表达株时,p100后面带有一个Flag小肽)进行免疫沉淀(抗IgG抗体作为阴性对照),钓取核裂解液中的p100蛋白,然后用葡聚糖颗粒纯化与p100蛋白结合的复合物,之后进行SDS-PAGE电泳分离结合的蛋白组分,再用抗Flag抗体和抗hPrp8抗体检测p100蛋白与hPrp8蛋白能否在细胞内结合；另一部分HeLa-p100稳定表达细胞株的核裂解液与抗hPrp8抗体进行免疫沉淀,钓取核裂解液中的hPrp8蛋白,然后用葡聚糖颗粒纯化与hPrp8蛋白结合的复合物之后进行SDS-PAGE电泳分离结合的蛋白组分,用抗Flag抗体和抗hPrp8抗体再一次检测p100蛋白与hPrp8蛋白能否在细胞内结合。为了进一步确定p100蛋白与hPrp8蛋白结合的部位,再次使用GST融合蛋白钓取法和Western Blot技术,将p100蛋白SN片段和TD片段的GST融合蛋白(GST空载作为阴性对照)与HeLa-p100稳定表达株的核裂解液孵育一定时间后进行SDS-PAGE电泳,用抗hPrp8抗体检测是p100蛋白的SN样功能片段还是TD功能片段与hPrp8蛋白结合。第二部分为了进一步确定p100蛋白与hPrp8蛋白结合的功能区域,需要构建以下重组质粒：(1)构建hPrp8和hSnu114全长序列真核表达质粒。应用逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)技术扩增hPrp8和hSnu114的全长序列,hPrp8分成4段彼此有一小段重复序列(约十几个碱基)的片段,hSnu114分成两个片段扩增。这些片段中都含有特异的酶切位点(在序列中是单一的酶切位点),目的是为将来能够连接成全长序列。由于hPrp8序列比较长(7.2kb),优先考虑使用重叠延伸PCR法将4个RT-PCR片段连成全长并亚克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(+)中。hSnu114序列为2.9kb,可以利用自身含有的单一酶切位点将两段RT-PCR片段连成全长并亚克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(-)中。这2种质粒可以作为体外翻译hPrp8和hSnu114蛋白时的DNA模板,用于研究p100蛋白与hPrp8和hSnu114蛋白在体外的相互作用；(2)hSnu114的pEGFP C I及带有6个组氨酸标签(设计反义引物时引入6个组氨酸密码子,后面为终止密码子)的pcDNA3.1(-)全长重组质粒。分别选择Sal I/BamH I和Xba I/BamH I限制性内切酶将hSnu114全长序列定向克隆至pEGFP C I和pcDNA3.1(-)载体中。由于hPrp8序列较长,在构建这2种质粒时存在一定的困难,但现有研究表明hPrp8和hSnu114这2种蛋白在细胞内是以复合物的形式存在的,即通过hSnu114蛋白可以预见hPrp8蛋白与p100蛋白之间的作用。利用免疫荧光技术研究hSnu114和hPrp8蛋白与p100蛋白在细胞内结合的情况。将hSnu114的pEGFP C I重组质粒瞬时转染HeLa/COS7细胞,观察胞内绿色荧光,凡是有绿色荧光的地方就表示hSnu114蛋白的存在,待细胞贴璧后(转染后6-8个小时)先后加入第一抗体(与胞内p100蛋白结合)和红色荧光标记的第二抗体(与一抗结合),于荧光倒置显微镜下观察同一视野下的荧光定位。此外,还可以应用hSnu114的带有6个组氨酸标签的pcDNA3.1(-)全长重组质粒,利用免疫共沉淀的方法研究hPrp8蛋白与p100蛋白之间的作用机制。(3)构建hPrp8和hSnu114功能片段的pGEX-4T-1重组质粒,利用GST基因融合系统在体外表达相应功能片段的GST融合蛋白。hPrp8和hSnu114都存在着介导不同生物功能的功能片段。根据文献报道我们设计了相关的功能片段,(4)构建hPrp8和hSnu114功能片段的pBluescript SK重组质粒。这些重组质粒可作为体外翻译的DNA模板,在体外翻译出相应功能片段用同位素标记的蛋白。构建hPrp8和hSnu114功能片段的pGEX-4T-1重组质粒和pBluescript SK里组质粒的目的是进一步研究hPrp8、 hSnu114和p100蛋白三者之间的作用区域。第三部分利用TNT⑧T7体外翻译系统在体外合成带有35S标记的p100蛋白和hPrp8功能片段,用GST pull down (GST融合蛋白钓取1法研究hPrp8的哪一段功能片段能够与p100蛋白的Tudor片段结合：(1)在体外应用GST gene fusion system表达p100蛋白TD功能片段的GST融合蛋白(GST-pl00-TD)(GST空载表达的蛋白作为阴性对照),与体外翻译35S标记的hPrp8蛋白的功能片段孵育后,经SDS-PAGE电泳和放射性自显影观察感光底片,GST阴性对照未出现hPrp8蛋白功能片段的体外翻译产物而GST-p100-TD出现了其相应体外翻译产物的情况,我们认为是阳性结果；(2)hPrp8各功能片段的GST融合蛋白与体外翻译35S标记的p100蛋白一起孵育,SDS-PAGE电泳和放射性自显影观察感光底片p100蛋白体外翻译产物出现的情况。结果：第一部分p100蛋白与hPrp8在细胞内结合的研究结果显示：(1)p100蛋白能够与一组U5snRNP特异蛋白结合,经过质谱分析p100蛋白TD片段能够结合的U5snRNP特异蛋白为hPrp8蛋白、hBrr2蛋白、hSnu114蛋白,分子量分别为220kDa、200kDa和116kDa；(2)p100蛋白可与hPrp8蛋白在细胞内结合,但不能够确定它们是直接结合还是间接结合；(3)p100蛋白的TD片段能够与hPrp8蛋白在体外直接结合而SN片段不能与其结合。为了鉴定p100蛋白的TD功能片段与hPrp8的哪一段功能片段结合,第二部分成功构建了以下重组质粒：(DhPrp8和hSnu114全长序列pcDNA3.1(+/-)真核表达质粒；②hSnu114的pEGFP C I和带有6个组氨酸标签的pcDNA3.1(-)全长重组质粒；③hPrp8和hSnu114功能片段的pGEX-4T-1重组质粒；④hPrp8和hSnu114功能片段的pBluescript SK重组质粒,并应用这些功能性重组质粒在体外研究hPrp8和hSnu114蛋白与转录共激活因子p100蛋白之间的作用机制。在成功获得这些重组质粒的基础上,第三部分p100蛋白与hPrp8蛋白在体外结合的研究结果显示p100蛋白的TD片段与hPrp8蛋白的第二个功能片段(Domain2)稳定结合。结‘论：本课题研究结果表明(1)p100蛋白参与组成U5snRNP复合物；(2)p100蛋白的TD片段能够与hPrp8的功能片段2稳定结合；(3)p100蛋白可能通过结合hPrp8功能片段2,进而参与前体mRNA的剪接加工作用。