曲古菌素A体外作用HeLa细胞的光谱学研究

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光谱技术是一种高度灵敏的检测手段,是精确地分析和了解物质结构,成分及其含量行之有效的方法,适合于对细胞状态和生物分子以及分子所处微环境的物理、化学特性进行研究。相对于其它传统生物学的研究方法,光谱技术具有非破坏性、非侵入性、不用试剂和高度自动化等优点。HeLa细胞因在世界各地的实验室中被广泛应用于癌症研究而著名。该细胞株是由正常子宫颈细胞被一种人类乳突状瘤病毒(HPV18:Human Papillomavirus18)转型而成的癌细胞,和其他癌细胞相比,HeLa细胞增殖异常迅速,可以不限次数的分裂下去。曲古菌素A(trichostatin A,TSA)是链霉素代谢产物,其以纳摩尔的浓度特异抑制组蛋白去乙酰基酶,是目前国际上公认的研究乙酰基化对细胞影响的可靠模式。曲古菌素A可使肿瘤与正常组织中的组蛋白乙酰化,诱导转化细胞分化或凋亡,从而达到抗肿瘤的作用。本文研究了曲古菌素A作用于HeLa细胞后的紫外吸收光谱和拉曼光谱,旨在从分子层面上探讨曲古菌素A对癌细胞的作用机理,为将来曲古菌素A的临床应用奠定基础,也为其它潜在抗癌药物的筛选提供新的思路。论文主要从三个方面开展实验研究工作,得出以下重要结论:1.研究了不同剂量TSA处理24h、48h的HeLa细胞形态和增殖变化。结果表明200nmol/L的TSA所处理的细胞,与对照细胞的形态及数量相比均差异显著。2.研究了不同剂量TSA处理24h、48h的HeLa细胞紫外吸收光谱。结果表明200nmol/L的TSA可使HeLa细胞在260nm处的吸收值最大。3.研究了不同剂量TSA处理24h、48h的HeLa细胞拉曼光谱。结果表明,蛋白质二级结构及侧链氨基酸、碱基、磷酸骨架、脂类的谱线都与TSA剂量存在一定的关系:(1) TSA处理24h造成细胞内归属蛋白质二级结构酰胺Ⅰα-螺旋的1658cm-1和938cm-1峰位强度下降,但200nmol/L剂量的TSA对其影响相对较小。表征酰胺Ⅲ无规则卷曲的1241cm-1峰位强度在加药样品中呈现下降趋势,而200nmol/L TSA处理对其影响相对较小。酪氨酸弯曲振动在200nmol/L TSA处理的样品中达到最强,而后随TSA剂量增加又有降低的趋势。色氨酸残基的吲哚环在200nmol/LTSA处理的样品中拉曼峰强最高、峰型尖锐,处于“埋藏式”,当TSA剂量进一步增大时,色氨酸残基有逐步暴露出来的趋势。(2) TSA处理细胞24h后,细胞1094cm-1峰强度明显降低,而200nmol/LTSA处理的样品拉曼峰强有所增加,当剂量进一步增加,样品的该峰位相对强度又降低。表征A和G的1342cm-1振动在50nmol/L TSA处理的样品中无明显变化,100nmol/L TSA处理的样品拉曼峰强达到最高,随着剂量的进一步增大,样品的拉曼峰强反而降低。归属A和G的1584cm-1峰位,在TSA剂量为50nmol/L和100nmol/L处理的样品光谱中分别红移了3cm-1和5cm-1,到200nmol/L TSA处理的样品中又回到1585cm-1。说明低剂量TSA作用使DNA链断裂,振动减弱,而较大剂量TSA可能使得HeLa细胞内DNA与组蛋白之间的相互作用减弱,DNA更易于解聚。(3) TSA处理细胞24h后,归属脂类C-C伸缩振动的拉曼特征频率1067cm-1的峰强降低,大剂量TSA处理的样品尤为明显。说明脂类受到TSA的影响,有序度降低,C-C伸缩振动减弱。(4)细胞经TSA作用48h的拉曼光谱变化趋势同24h,特别指出,相对于对照样品,100nmol/LTSA作用48h的样品和200nmol/LTSA作用24h的样品的光谱变化基本一致。说明因TSA作用时间的增加,原本较高剂量所达到的效果,在较低剂量的处理中就能够出现。(5) 200nmol/L的TSA处理细胞24h和48h的拉曼光谱存在差异,即处理48小时的样品中各个峰的强度普遍低于处理24小时的样品,但1314cm-1峰位强度却增强。说明因为TSA作用时间的增加,细胞的形态变得更不规则,使得细胞中以脂类为主要成分的细胞膜面积增加,脂类含量增多,加之构象的改变,导致表征脂类中CH键无规则卷曲振动的拉曼峰位强度增大。
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