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目的: 探讨PgP蛋白与GIST伊马替尼耐药的关系,观察PgP蛋白在GIST伊马替尼耐药中的作用。 方法: 1、研究对象:收集中国医科大学附属盛京医院医院2007-2013年资料完整,选取因胃肠道间质瘤行手术切除,术后口服伊马替尼治疗,其间控制良好,后因继发耐药复发行第二次手术治疗的患者作为研究对象。 2、实验方法 (1)免疫组化染色检测PgP蛋白表达 采用SP方法对胃肠道间质瘤组织芯片进行免疫组化染色。Immuno-Bridge+试剂盒,小鼠抗人PgP单克隆抗体(工作浓度1∶150)分别够于北京中杉金桥和武汉博士德生物技术有限公司。所有步骤依据产品说明书进行,利用PBS((0).01mol/L,PH7.4)替代一抗作为阴性对照。 免疫组化染色结果判定:PgP蛋白免疫染色阳性信号定位于细胞浆和细胞膜,呈棕黄色颗粒。每张切片随机挑选10个200倍视野采集图片。应用Image-ProPlus6.0软件分析累积吸光度值(IOD值)。IOD值越大,阳性表达越强。每组照片的平均IOD值用均数±标准差表示。 (2)经机械分离法获得GIST原代细胞后,予含20%胎牛血清的DMEM高糖培养基,置于37℃、5%CO2细胞培养箱内培养,观察细胞形态及生长状态,利用免疫组织化学等方法鉴定细胞是否为胃肠道间质瘤细胞。 (3)通过MTT的方法,观察不同浓度及时间的Imatinib对GIST细胞的生长抑制作用,利用Hochest33258荧光染色观察不同药物浓度时细胞的凋亡情况; (4)WesternBlot检测PgP蛋白表达 组织以1∶5比例加入裂解缓冲液提取组织蛋白;样品(蛋白)浓度的定量采用考马斯亮蓝法;蛋白质进行12%浓度的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳;硝酸纤维素滤膜,转膜2h;与一抗(Pgp工作浓度1∶500)室温下孵育2h;辣根过氧化物酶标记的二抗(工作浓度1∶1000)室温孵育1h;免疫印迹化学发光试剂(ECLReagent)显示免疫反应条带;采用GEL-XR凝胶成像系统将将电泳结果成像;BANDSCAN5.0软件系统采集数据,采用目的蛋白条带光密度值与相应β-actin光密度值的比值作为相对表达水平指标,进行统计学分析。 3、统计学分析 连续型数据用(x)±s表示,采用SPSS13.0统计软件包进行分析,定性资料采用卡方检验(Fisher精确概率法)和计量资料t检验,Spearman等级相关检查。P<0.05为差异有统计学意义。P<0.01为差异有显著统计学意义。 结果: 1、Pgp蛋白在用药后的GIST组织、细胞中的表达明显高于用药前。 2、成功提取并培养胃肠道间质瘤细胞。 结论: PgP蛋白在伊马替尼继发耐药的GIST组织中高表达,高表达Pgp蛋白有可能能促进GIST细胞耐药。