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目的了解目前云南省、江苏省和河南省中华按蚊对溴氰菊酯抗药性的基本情况,调查钠离子通道基因(Kdr基因)突变频率。探讨药膜接触时间和受试样本量对WHO抗性生测结果的影响。初步分析表皮蛋白基因(insect cuticle proteins genes, ICPG)与中华按蚊抗药性之间的关系,探讨其表达量在蚊不同生长发育阶段的变化规律。方法(1)选择云南省盈江县、江苏省睢宁县及河南省开封县为调查点,进行中华按蚊的现场采集及饲养工作,通过抗药性生物测定收集得到足够的现场抗性蚊和敏感蚊,以及1-2龄幼虫、3-4龄幼虫、蛹、0d成蚊、5d成蚊、10d成蚊、15d成蚊等不同发育阶段的蚊样。(2)现场进行抗药性生物测定。包括按世界卫生组织(WHO)标准进行的中华按蚊群体抗药性水平测定,受试样本量一定时不同药膜接触时间下的抗药性测定和药膜接触时间一定时不同受试样本量下的抗药性测定。用SPSS19.0对三个调查点的受试蚊虫生测校正死亡率进行卡方检验。(3)应用PCR对Kdr基因ⅡS6段进行扩增并测序,分别检测存活蚊和死亡蚊的Kdr等位基因突变频率,用卡方检验或Fisher确切概率法比较。同时用卡方检验比较三个调查点存活蚊Kdr等位基因突变频率。(4)通过生物信息学分析筛选出与抗性有关的中华按蚊ICPG,用荧光定量PCR(RT-qPCR)测定其在各样本中的表达量。采取相对定量的2-△△Ct计算法处理荧光定量PCR实验数据。现场抗性蚊、敏感蚊和实验室对照敏感蚊的ICPG表达量比较用Kruskal-wallis检验。对不同发育阶段蚊的ICPG表达量用方差分析比较,用GraphPad prism 5制作统计趋势图。结果(1)云南盈江县、江苏睢宁县和河南开封县中华按蚊均为抗性水平(R),24 h校正死亡率分别为67.42%、54.33%和47.40%(χ2=12.240,P<0.05)。三地区抗性蚊Kdr突变频率分别为4.0%、96.0%和100%(χ2=31.26,P<0.05)。在盈江县和睢宁县,存活蚊和死亡蚊之间Kdr突变频率差异无统计学意义(P=0.190,0.628,P均>0.05)；但在开封县有统计学意义差异(χ2=75.81,P<0.05)。(2)对WHO抗性生测方法的研究中发现,受试样本量一定时,rKD随着药膜接触时间增加而增大,于80 min时达到峰值,开封县为66.78%,盈江县为71.30%,而后进入平稳期。药膜接触时间一定时,受试样本量越少,击倒越迟。(3)荧光定量PCR结果表明,CPF3和CPLCG3在现场抗性蚊体内的表达量显著高于敏感蚊及实验室对照敏感蚊,差异有统计学意义(P<0.01), CPR30仅在抗性蚊体内特异性表达。(4) ICPG在中华按蚊不同生长发育阶段(1-2龄、3-4龄、蛹、0 d、5d、10d、 15d)表达具有差异性。CPLCG3随蚊龄的增加而增加,CPF3和CPF4在成蚊中特异性表达,CPR78在蛹期特异性表达。结论(1)各地区调查点的中华按蚊仍为溴氰菊酯高抗性群体。不同地区中华按蚊抗性机制不同,Kdr突变在抗性产生中发挥的作用也不同。(2)药膜接触时间和受试样本量对中华按蚊抗药性测定结果有影响。对抗性水平较高的蚊虫,应延长药膜接触时间至80 min;如何减少接触筒中受试蚊虫的数量而又能获得其抗性水平,需要进一步的实验验证及相应数理统计模型的建立。(3)中华按蚊ICPG在现场抗性蚊和敏感蚊之间表达具有差异性,且随着蚊龄的变化而变化。