食品安全问题目前在我国已经成为一项非常严峻的社会民生问题,而其中兽药的非法添加及滥用是引起动物性食品危害的主要原因之一。雌二醇是一种小分子甾体类激素,喂食或在皮下埋植可起到促进动物食欲、增加体重、提高蛋白转化率、改善瘦肉比、增加产率等作用,因此在畜禽养殖业中曾被广泛应用。而美国环境保护局早在1996年就将其划定为环境内分泌干扰物之一,多国均对其制订了相关限量标准,我国农业部更明确规定雌二醇不得在动物性食品中检出。环境内分泌干扰物可通过食物链的富集作用对人体以及整个自然生态环境产生一系列的危害,其中牛奶及乳制品中雌二醇等雌激素残留的问题已经严重威胁到了我国青少年儿童的身体健康,因此对其在食物中的残留进行严格有效的监控是十分必要的。目前用于雌二醇检测的多为色谱-质谱联用技术,这些方法需要大型昂贵的仪器及专业人员的操作,样品前处理复杂耗时,难以满足食品安全现场快速的检测要求。为了有效的维护食品安全、控制兽药滥用,在此我们建立了一种高效、灵敏的用于雌二醇的酶热传感检测方法并初步应用于牛奶样品的检测。该方法基于直接竞争法的免疫学检测原理,同时充分发挥了酶热传感技术快速、简便、特异的优点,无需繁琐的样品前处理工作,获得结果稳定可靠。本研究的研究内容主要从以下几方面展开:1)雌二醇的羧基化改造、偶联及单克隆抗体的纯化由于雌二醇是小分子类物质,不便于在实验中应用,通过加入KOH及溴乙酸,应用乙酸乙酯萃取及甲醇-氯仿重结晶对其进行了羧基化改造,并通过EDC方法与目标酶蛋白偶联。通过核磁氢谱鉴定改造产物E2-3-CME,通过质谱鉴定羧基化雌二醇与β-内酰胺酶偶联成功,偶联比约为12:1。同时采取辛酸-硫酸铵盐析法对雌二醇单克隆抗体进行了纯化,通过ELISA鉴定其性质良好并初步确定了用于下一步检测的抗原-抗体稀释比例。2)酶热传感检测体系的优化实验中采用TELISA技术,使用琼脂糖凝胶颗粒SPG作为填充酶柱的固相载体吸附雌二醇抗体,待测样品中雌二醇与β-内酰胺酶标记的雌二醇竞争结合抗体上的位点,通过加入β-内酰胺酶对应底物产生的热信号推算待测小分子的浓度。对实验中所涉及的反应底物、系统流速、载液、再生等参数进行逐步优化。最终确立酶热检测体系如下:体系温度37℃,,底物氨苄西林(4mmol/L);抗原抗体稀释比E2 1:200/E2-m Ab 1:16000;载液0.02mol/LPBS+2%DMSO+0.5%甘油,p H7.0;再生条件:0.1mol/LGly-Hcl+0.5mol/LNacl+1%DMSO+0.1%Triton X-100,p H2.3(变速1200u L/min×6分钟);系统流速400μL/min;样品共同孵育30min/共同进样;进样时间:6min30sec。以上所用的稀释液及载液均经0.22μm滤膜过滤、超声除气及37℃恒温水浴。3)构建了用于雌二醇检测的酶热传感检测方法在系统优化的基础上绘制标准曲线,E2标准品用纯DMSO溶解后进行从0到200ng/ml之间9个点的梯度稀释,依标准程序打开酶热传感器,待基线平稳后依次加样(每次进样量350μl)-再生-记录峰信号;同等条件下重复试验3次,取均值绘制标准曲线。结果标准曲线为:Y=96.4438+(6.7545-96.4438)/(1+(x/10.57676)^2.5011),R2=0.9902,IC50值:10.2ng/m L,线性检测范围:5.1-19.4 ng/m L,最低检测限2.8ng/m L。在E2 12.5ng/m L浓度测定稳定性良好,X±S:80.8±2.8mv,CV:3.4%(n=6、峰高值)。与雌激素类结构类似物雌酮、雌三醇、左炔诺孕酮及己烯雌酚依次检测,交叉反应率均低于0.01%,特异性良好。优化建立了一种简易的牛奶样品前处理方法:将液态牛奶样品分装后离心30分钟,抽取中层乳清层,-20℃储存备用。获取的牛奶样品可顺利应用于酶热传感设备的检测,空白样品基质干扰信号可以忽略。在此基础上绘制了基于牛奶模拟样品的标准曲线:Y=97.91128+(2.91161-97.91128)/1+(X/0.32696)^2.32955,R2=0.9982,IC50值:0.45ng/m L,线性检测范围:0.24-0.79ng/m L,最低检测限0.12ng/m L。测定加标回收率均集中在100%附近,与大型仪器LC-ESI-MS进行方法比对后具有良好的一致性。目前酶热传感技术较少有报道应用于农兽药残留的检测,在激素类小分子物质的检测方面更是空白,本研究构建了一种适用于食品安全现场检测工作的快速、高效、简便且经济的检测方法,拓展了酶热技术的应用,具有广泛的应用及发展前景。在固定化酶柱方面引入了SPG作为检测中吸附抗体的固相载体,既省略了固定化酶(或其它生物识别原件)的步骤,又实现了更换抗原-抗体对子即可更换检测目标物的目的,从而使这一传感技术具有了良好的通用性。通过对牛奶模拟样品的检测,探索出了一种快速有效的牛奶样品前处理方法,可达到较好的检测灵敏度和稳定性,同时也为今后应用于其他方面食品的检测提供了思路。实验中获得的检测低限较为理想,但检测范围偏窄,可能与雌二醇在牛奶样品中代谢分布的复杂性有关,在实际操作时可采取稀释的步骤以获取准确的检测值,同时在下一步的研究中仍将进一步探索改进。