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目的:本研究旨在通过检测胃溃疡(GU)大鼠模型溃疡指数(UI)、细胞凋亡指数(AI)等指标的变化及对胃粘膜上皮凋亡细胞的观察,探讨其对GU大鼠粘膜再生和愈合功能的影响,并用纯中药复方制剂芍药愈疡汤进行干预,同时以中成药胃苏颗粒做对照,观察芍药愈疡汤对乙酸致大鼠胃溃疡治疗的作用机理及对胃粘膜上皮细胞原位凋亡的影响,为临床治疗提供实验依据。
方法:清洁级SD雄性大鼠80只,体重200±20g,置于实验环境中适应性喂养1周,室温22℃~24℃。随机取出20只大鼠,作为空白对照组,不造模,正常喂养。其余60只大鼠按照Takagi的方法于胃窦部前壁浆膜下近肌层处注射100%冰乙酸10μl复制GU模型。
GU模型复制成功后,将GU模型大鼠随机分为模型对照组(简称模型组)、胃苏颗粒组(简称WS组)、芍药愈疡汤组(简称SYYY组)3组,每组20只。
造模后3d开始用药干预。大鼠剂量按动物体表面积以成人用量折合,200g大鼠每日用量为成人剂量的0.036倍。芍药愈疡汤(白芍、柴胡、木香、砂仁、白术、蒲公英、丹参、白及、乌贼骨、元胡、三七、甘草等)按以一定比例混合后,按汤剂的要求水煎后浓缩,每毫升含中药2.7g。SYYY成人每日量为27g,则大鼠每日量为0.972g/200g,WS组成人每日量为15g,则大鼠每日量为0.54g/200g体重,容量均为2ml,用蒸馏水稀释,每日1次灌胃,空白组和模型组灌等容量的生理盐水,连续灌胃7d和14d之后观察。
各组在停药24h后,断颈处死大鼠,打开腹腔,结扎贲门和幽门后将鼠胃取出,沿胃大弯切开胃,生理盐水冲洗干净后,放入4%中性甲醛溶液中固定1h取出。将胃平摊固定在小木板上,胃粘膜面朝上,测定溃疡大小,计算溃疡指数(UI)。取溃疡周围组织切成0.5cm×1cm左右的小块,再回置于4%中性甲醛溶液中固定15h。常规脱水,石蜡包埋,制备5mm厚连续切片。运用HE染色,光学显微镜观察溃疡部组织结构,TUNEL法检测原位细胞凋亡,电子显微镜观察凋亡细胞并计数,计算细胞凋亡指数AI。
结果:
1一般状态观察
造模组大鼠于注射100%冰乙酸3天后开始出现食欲下降、活动减少、四肢无力、蜷卧嗜睡、行动迟缓、毛发蓬松不荣,。正常对照组则健康如初,未见任何异常。
2芍药愈疡汤对GU大鼠溃疡指数的影响
结果显示,模型组7天后的溃疡指数为(5.31±0.69),14天后的溃疡指数为(4.13±0.72);WS组7天后的溃疡指数为(2.75±0.55),14天后的溃疡指数为(1.96±0.42);SYYY组7天后的溃疡指数为(1.67±0.48),14天后的溃疡指数为(0.80±0.42)。SYYY组、WS组与模型组相比有显著性差异(P<0.05或P<0.01);SYYY组与WS组相比有显著性差异(P<0.05);SYYY组与空白组相比UI无统计学意义(P>0.05)。各组间14天后的溃疡指数较7天后的溃疡指数均明显缩小,有显著性差异(P<0.05)。
3芍药愈疡汤对GU大鼠胃组织一般形态学的影响
结果显示,光学显微镜观察,空白组胃组织形态结构规则,无白细胞浸润,胃腺体结构完整;模型组可见典型的胃溃疡组织结构,溃疡深入至肌层,有的甚至穿透肌层达到浆膜层,周边有许多坏死组织,炎性细胞浸润明显,溃疡边缘粘膜腺体间质充血水肿,粘膜上皮细胞无增殖,溃疡底部肉芽组织结构紊乱,胃腺体和毛细血管少见;SYYY组溃疡部周边上皮细胞移行到肉芽组织表面,覆盖了溃疡底部,部分胃腺体重建,部分呈囊状扩张。胃粘膜层、肌层和浆膜层结构清晰,粘膜层有少量白细胞浸润,毛细血管网数量减少;WS颗粒组溃疡部周边炎症浸润,上皮细胞增殖,溃疡已深入肌层,底部肉芽组织结构紊乱,胃腺体囊状扩张,可见毛细血管网再生。
4芍药愈疡汤对GU大鼠胃组织细胞凋亡的影响
4.1胃组织细胞凋亡细胞分布特点
结果显示,电子显微镜下观察,SYYY组、WS组与模型组均可见散在的单个凋亡细胞,凋亡小体形成。光学显微镜下观察,空白组和SYYY组凋亡细胞数量不多,主要分布在胃粘膜表层;模型组和WS组凋亡的阳性细胞明显多于空白组和SYYY组,在整个胃小凹均可见到,分布无一定规律。
4.2细胞凋亡指数(AI)分析
结果显示,7d后的AI,空白组在胃粘膜表层和胃粘膜层底部分别为(1.80±0.39)和(0.51±0.37);模型组分别为(9.68±0.87)和(4.07±0.44);WS组分别为(8.89±0.68)和(4.10±0.38)SYYY组分别为(3.01±0.41)和0.53±0.32)。14d后的AI,空白组在胃粘膜表层和胃粘膜层底部分别为(1.78±0.42)和(0.52±0.39);模型组分别为(7.53±0.61)和(2.22±0.45);WS组分别为(6.74±0.53)和(2.17±0.53);SYYY组分别为(1.96±0.38)和(0.52±0.33)。经统计学处理,表明实验7天后,在粘膜表层SYYY组AI明显低于模型组和WS组,但明显高于空白组,均有非常显著性差异(P<0.01);WS组AI明显低于模型组,有显著性差异(P<0.05),但明显高于SYYY组和空白组,有非常显著性差异(P<0.01)。在粘膜层底部SYYY组AI明显低于模型组和WS组,有非常显著性差异(P<0.01),与空白组比较无显著性差异(P>0.05);WS组AI明显高于SYYY组和空白组,有非常显著性差异(P<0.01),与模型组比较无统计学意义(P>0.05)。实验14天后,在胃粘膜表层和胃粘膜层底部,SYYY组AI明显低于模型组和WS组,有非常显著性差异(P<0.01),但与空白组比较已无显著性差异(P>0.05);WS组AI明显低于模型组,有显著性差异(P<0.01),但仍明显高于SYYY组和空白组,有非常显著性差异(P<0.01)。组间比较,SYYY组、模型组和WS组14天之后的AI较7天后的AI明显减少,有显著性差异(P<0.01)。各组胃粘膜层底部的AI在同一时间内均明显低于胃粘膜表层(P<0.01)。
结论:
1芍药愈疡汤能显著降低乙酸致大鼠胃溃疡的溃疡指数,从而对胃溃疡起修复作用。
2芍药愈疡汤能显著减少胃溃疡大鼠胃粘膜上皮细胞凋亡,明显降低细胞凋亡指数,改善胃粘膜过度凋亡状态,有助于溃疡的修复,提高溃疡愈合质量。