目的：　　 采用Solexa高通量测序技术获得膀胱癌(BCa)sRNA表达情况，深入分析BCasRNA长度分布及分类注释，筛选出BCamicroRNAs(miRNAs)差异表达谱，根据miRNAs前体特征预测获得BCa新miRNAs，为进一步研究miRNAs在BCa发生发展过程中可能的作用机制奠定基础。　　 方法：　　 1．收集正常膀胱粘膜(NBE)组织及BCa组织，选取20例中分化或低分化的BCa组织，10例NBE组织。对BCa组织进行冰冻切片，每个样本连续切两张8μm切片，一张进行常规HE染色，判断是否为膀胱移行细胞癌(BTCC)并观察肿瘤细胞的分布情况，另一张用美国Arcturus公司HistoGeneTMLCMFrozenSectionStainingKit片进行染色以供激光捕获显微切割技术(LCM)使用，使用美国AruturusXTMicrodissectionSystem及CapSureTMHSLCMCap获得纯化的BCa细胞群，将20例纯化癌细胞群等比例混合为一个样本，建立实验组混合样本池。10例NBE组织也等比例混合为一个样本，建立对照组混合样本池。　　 2．采用美国Arcturus公司PicoPureTMRNAIsolationkit分别提取实验组和对照组总RNA，此过程严格按照试剂盒说明书进行。　　 3．利用美国Agilent公司Agilent2100仪对总RNA样品的纯度和浓度进行检测。　　 4.15％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离获得18-30nt的sRNA，采用T4RNA连接酶将5’端接头（5’-GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC-3’）连接至RNA5’端。15％琼脂糖凝胶电泳分离上述RNA片段获得40-60ntsRNA，利用T4RNA连接酶将3’端接头（5’-pUCGUAUGCCGUCUUCUGCUUGidT-3’；p；磷酸化；idT;倒置脱氧胸腺嘧啶核苷）连接至RNA3’端。10％琼脂糖凝胶电泳获得70-90nt包含接头的sRNA片段后，进行RT-PCR（SuperscriptⅡ逆转录酶，14个循环）获得测序文库。　　 5．纯化PCR产物后，利用美国Illumina公司Illumina1GGenomeAnalyzer对实验组与对照组sRNA文库进行新一代高通量Solexa测序。　　 6．分析sRNA的长度分布情况及实验组与对照组的公共序列和特有序列。　　 7．采用SOAP程序将获得的＞18nt的cleanreads与人基因组比对，与miRBase14.0、重复序列、NCBIGenbank、Rfam9.1、内含子、外显子及piRNA数据库比对，获得各类sRNA表达情况，与上述数据库不匹配的sRNA用unann表示。　　 8．将所有sRNA与各类RNA的比对、注释情况进行总结。在以上各注释信息中，有可能存在一个sRNA同时比对上两种不同的注释信息的情况。为了使每个uniquesRNA有唯一的注释，按照rRNA＞knownmiRNA＞repeat＞exon＞intron的优先级顺序将sRNA遍历。由于rRNA是由NCBIGenbank和Rfam两个数据库比对所得，规定这两个数据库间的优先级为Genbank＞Rfam。利用miRNAs前体特征性的茎环结构、unannsRNA及Mireap软件预测BCa中的新miRNAs。　　 9．采用log2比值及Audic-Claverie计算方法分析实验组与对照组间差异表达的miRNAs，当差异倍数(log2)≥1、p≤0.001、FDR＜0.01时，差异有显著性意义。　　 结果:　　 1．Agilent2100仪对实验组与对照组总RNA样品进行检测的结果显示：实验组总RNA的RIN值为8.6，28s:18s=1.7，浓度＞100ng/μl，总量＞2.0μg，对照组总RNA的RIN值为7.8，28s:18s=1.5，浓度＞100ng/μl，总量＞2.0μg。所获得的实验组和对照组总RNA均未发生降解，其完整性、纯度、浓度及总量均符合进行Solexa测序样品制备的要求。　　 2．成功建立实验组与对照组测序文库，并顺利进行Solexa测序，实验组与对照分别获得了11，146，610，与10，263，845高质量的测序reads。去掉接头序列、低质量测序reads、污染reads后，分别获得9，856，802与10，059，359sRNA序列。经初级信息分析得到：22nt的序列为实验组最常见的序列，同时，20nt与22nt序列在对照组中所占的比例达59.55％;实验组与对照组公共序列总数达18，099，803，实验组特有序列1，009，029，占总序列的5.19％，对照组特有序列333，535，占总序列的1.72％。　　 3．Solexa测序所得的＞18ntcleanreads与人基因组序列进行比对分析，结果显示测序结果与基因组序列有良好的符合率。实验组每条sRNA序列的表达量与基因组序列的符合率是84.57％;对照组每条sRNA序列的表达量与基因组序列的符合率是73.90％。　　 4．通过与miRBase14.0比对，实验组共获得884种miRNAs，其中包括374种成熟miRNAs、111种miRNAs*及399种miRNAs前体，对照组共获得930种miRNAs，其中包括394种成熟miRNAs、127种miRNAs*及409种miRNAs前体。　　 5．实验组重复序列大部分集中在rRNA:1与tRNA:1位置，对照组重复序列绝大部分集中在rRNA:1位置。成功将测序reads与NCBIGenbank、Rfam9.1、内含子、外显子及piRNA数据库比对，并进行了sRNA分类注释，实验组与对照组分别获得了3,736,325与5,514,563候选miRNAsreads。　　 6．采用Mireap软件共预测出13个在实验组与对照组均表达的新miRNAs。　　 7．以差异倍数(log2ratio)≥1.0和p≤0.001为标准筛选出实验组和对照组间差异表达的miRNAs共74个，其中33个表达上调，41个表达下调。　　 结论：　　 我们的研究结果表明BCa相关的miRNAs包括大量已知的保守miRNAs及一些低丰度的新miRNAs。这些已知的、新发现的miRNAs拓展了我们对BCamiRNAs表达谱的认识，为miRNAs在BCa肿瘤形成及肿瘤治疗方面提供了新的视点。后续研究将深入探讨miRNAs在BCa发病过程中的可能机制，并有望进一步为BCa的诊断、预后判断及基因治疗提供相应的指标及靶点。