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目的构建趋化因子受体CXCR4(CXC chemokine receptor-4)小分子干扰RNA(siRNA)的表达载体,研究其对乳腺癌细胞体外侵袭能力的影响;探讨mRNA局部结构对RNA干扰效果的影响,为选择和设计有效的siRNA提供依据。方法1、设计合成人CXCR4基因不同靶点的能编码siRNA的2条双链DNA序列,并将之分别克隆到真核表达载体pGE-1-U6/kna中构建siRNA表达载体,采用内切酶酶切方法和基因测序测序方法对构建的表达载体进行鉴定。2、实验分为4组:空白对照组,CXCR4-siRNA1干扰组,CXCR4-siRNA2干扰组,CXCR4-siRNA1+CXCR4-siRNA2联合干扰组。在脂质体介导下,按照分组将所构建的表达载体体外转染分别导入各组CXCR4高表达的MDA-MB-231细胞,绘制转染前后各组细胞的体外生长曲线,作统计学对比,确定转染是否影响细胞的生物学活性和致瘤性。体外扩增培养各组细胞,收集细胞提取蛋白质,用Western blot分析CXCR4的蛋白表达,用transwell小室实验检测siRNA表达载体对细胞的侵袭能力,选出干扰能力最强的siRNA。对CXCR4的mRNA进行二级结构模拟,分析2段siRNA在靶序列位点的局部二级结构,找到靶序列二级结构与干扰效果之间的联系。结果1、酶切和基因序列测定均显示显示:插入位置和方向及序列大小与预期完全相符,证明克隆构建完全正确,成功构建了CXCR4的siRNA表达载体CXCR4-siRNA1和CXCR4-siRNA2。2、瞬时转染重组siRNA载体的细胞与原代细胞比较,细胞生长曲线较为一致(P＞0.05),提示MDA-MB-231细胞的生物学活性和致瘤性未受到转染过程的影响。重组siRNA载体能显著降低CXCR4的蛋白表达,空白对照组、CXCR4-siRNA1转染组、CXCR4-siRNA2转染组、CXCR4-siRNA1和CXCR4-siRNA2共转染组的CXCR4/β-actin分别为0.4532±0.0012、0.2103±0.0030、0.3922±0.0021、0.1089±0.0011。可有效抑制人类乳腺癌MDA-MB-231细胞的体外侵袭能力,CXCR4-siRNA1转染组、CXCR4-siRNA2转染组、CXCR4-siRNA1和CXCR4-siRNA2共转染组细胞的穿膜细胞数分别为(18.7±2.4)、(24.5±1.9)、(9.1±3.6)/mm~2,均少于空白对照组(48.3±1.7)/mm~2(P＜0.05)。结果表明,针对目标序列的siRNA均能对同源基因的表达产生一定程度的抑制,且siRNA1的干扰效果要优于siRNA2。与各表达载体单独作用相比,二者联合作用干扰效果更显著。mRNA二级结构分析表明,siRNA1的干扰靶点位于CXCR4的mRNA二级结构的环区,siRNA2位于茎区。结论成功构建了CXCR4-siRNA表达载体;并且能特异性的抑制乳腺癌细胞的CXCR4基因的蛋白表达,且能有效降低乳腺癌细胞的体外侵袭能力。针对二级结构环区目标序列的siRNA干扰效果优于针对二级结构茎区的siRNA,且针对同一个靶基因的不同靶点同时进行干扰的效果要好于单个靶点。认识到了RNA干扰效果与目标序列二级结构密切相关,在以后进行RNA干扰实验的目标序列选择时,应考虑二级结构的因素。进一步了解了乳腺癌转移的分子机制和RNA干扰作用机制,有望为乳腺癌转移的基因治疗开辟新途径。