溶藻弧菌是海洋环境中的一种条件致病菌,给水产养殖业带来了巨大的压力。而随着抗生素在水产养殖业的滥用,导致细菌的耐药性增强。丙酮酸激酶I（PykF）作为关键的代谢酶之一,可以调节细菌自身代谢以适应环境的变化,是潜在的抗菌药物靶点之一。溶藻弧菌的乙酰化蛋白质组学揭示PykF蛋白具有乙酰化位点。本研究用原核表达系统成功表达并纯化了PykF蛋白,并对其进行体外乙酰化和去乙酰化分析。自乙酰化分析表明PykF蛋可通过Ac P的途径进行乙酰化,不能通过Ac Co A的途径进行乙酰化。并且在一定范围内,随着Ac P的孵育时间和孵育浓度的增加,PykF的乙酰化水平升高,酶活性相应降低。去乙酰化分析表明,Cob B蛋白可以催化PykF蛋白去乙酰化,并且Cob B处理后PykF的酶活性增加;与野生株相比,cob B基因的缺失会增加PykF的乙酰化水平,但是丙酮酸激酶的活性无显著差异。使用Fast Mutagenesis System将PykF蛋白11个赖氨酸残基分别进行单位点突变为谷氨酰胺和精氨酸,再进行表达纯化,并测定其酶活性。结果表明,不同赖氨酸位点的去乙酰基对乙酰化水平的影响不同,K52、K68、K317或K382位点的去乙酰基显著降低了乙酰化水平,其他位点去乙酰基后的乙酰化水平并没有显著变化。K13、K368或K382位点的去乙酰基显著增强了丙酮酸激酶的活性,K145或K319位点的去乙酰基对其酶活性则无显著影响。另一方面,K52或K317位点的去乙酰基使丙酮酸激酶活性丧失了80%,K19、K59、K68或K340位点的去乙酰基则使其活性几乎丧失。与WT相比,ΔpykF的丙酮酸激酶活性降低了约60%。与ΔpykF:pykF回补株相比,定点突变回补株ΔpykF:K52R,ΔpykF:K68R和ΔpykF:K317R,丙酮酸激酶活性显著降低,说明K52、K68和K317的去乙酰基是调节溶藻弧菌丙酮酸激酶活性的关键。此外,比较了基因缺失株、回补株和点突变株的生长、胞外蛋白酶活性和LD50的差异。结果表明,WT:pykF过表达菌株的生长速率与野生型菌株相似,而ΔpykF突变菌株的生长速率明显降低。与ΔpykF:pykF相比,定点突变菌株的生长速率没有显著变化。与WT相比,WT:pykF胞外蛋白酶活性无显著差异,而ΔpykF突变株的胞外蛋白酶活性显著降低。与ΔpykF:pykF回补株相比,ΔpykF:K52R和ΔpykF:K68的胞外蛋白酶活性显著下降,而ΔpykF:K317R胞外蛋白酶活性无显著变化。ΔpykF菌株的LD50是WT的6倍。与ΔpykF:pykF相比,ΔpykF:K52R和ΔpykF:K68R的LD50约为ΔpykF:pykF的3倍和4倍,而ΔpykF:K317R没有显著变化。综上所述,本研究发现乙酰化修饰对PykF蛋白产生调控作用从而影响溶藻弧菌的毒力,这为开发新型抗菌药物靶点提供了新思路。