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肝脏是机体重要的代谢器官,肝损伤所致的肝脏功能失调,不仅危害患者健康,甚至可以危及患者生命安全。因此,积极探索肝损伤发病机制和寻找治疗策略,具有重要的临床意义。T GF-β1（transforming growth factorβ1）属于TGF-β家族成员,具有抑制肝细胞增殖及促进细胞外基质（extracellular matrix,ECM）生成等作用,被认为是诱导慢性肝损伤和肝纤维化的关键分子。果蝇Mad基因3哺乳动物类似基因（Mammalian homologs of the Drosophila Madgene3,Smad3）是介导TGF-β信号传导的重要分子,在慢性肝脏疾病及肝纤维化发生与发展过程中发挥重要作用。四氯化碳（c arbon tetrachloride,CCl4）诱导的肝损伤是典型的化学性肝损伤,相关文献以及实验室前期研究均表明T GF-β1/Smad3信号通路参与了CCl4诱导的慢性肝损伤的发生发展过程。但T GF-β1及其受体后信号分子Smad3在CCl4所致小鼠急性肝损伤时的表达及其作用机制仍不清楚。因此,本研究的目的是探讨C Cl4诱导小鼠急性肝损伤时T GF-β1及Smad3蛋白水平变化,以及改变S mad3表达对CCl4诱导小鼠急性肝损伤的影响及其可能的作用机制。1研究方法1.1 CCl4诱导小鼠急性肝损伤模型制备Balb/c小鼠36只,随机分为橄榄油对照组及CCl4实验组,橄榄油对照小鼠按照10ml橄榄油/kg体重进行腹腔注射;CCl4实验鼠按照0.5ml CCl4+9.5ml橄榄油/kg体重进行腹腔注射,分别于给药后的1天、3天及5天处死小鼠。1.2 Smad3基因过表达Balb/c小鼠随机分为4组:（1）橄榄油+PC（空载体pc DNA3质粒）组;（2）C Cl4+PC组;（3）橄榄油+Smad3（pc DNA3-Smad3表达质粒）组;（4）CCl4+Smad3组。每组18只小鼠,每只小鼠用Lipofectamine 2000包裹的3μg质粒（pc DNA空质粒或pc DNA3-Smad3质粒）尾静脉注射,质粒注射12h后,小鼠腹腔分别注射橄榄油（10ml/kg体重）及CCl4（0.5ml CCl4+9.5ml橄榄油/kg体重）,各组分别于橄榄油及C Cl4注射后1天、3天及5天处死小鼠。1.3 Smad3基因敲低Balb/c小鼠随机分为4组,分别为橄榄油+NC（p GCsi-U6/Neo空质粒对照）组、C Cl4+NC组、橄榄油+Smad3 sh RNA（p GCsi-U6/Neo-Smad3 sh RNA组）组及C Cl4+Smad3 sh RNA组。每组18只小鼠,按上述方法,每只小鼠用Lipofectamine 2000包裹的3μg质粒（p GCsi-U6/Neo空质粒或p GCsi-U6/Neo-Smad3 sh RNA质粒）尾静脉注射,质粒注射12h后,小鼠腹腔注射橄榄油（10ml/kg体重）或CCl4（0.5ml CCl4+9.5ml橄榄油/kg体重）,各组分别于橄榄油及C Cl4注射后1天、3天及5天处死小鼠。2研究结果2.1 CCl4处理小鼠血清ALT及AST水平及肝脏病理学变化血清A LT及AST水平变化与肝损伤程度相关。本研究结果显示,与橄榄油对照小鼠比较,小鼠腹腔注射C Cl4后血清A LT及AST水平明显升高;H&E染色结果显示,C Cl4腹腔注射1天的小鼠肝门脉及汇管区周围有大面积环状的坏死灶,3天时肝门脉及汇管区周围坏死面积减小,5天时门脉损伤区明显修复。上述结果表明实验成功制备了C Cl4诱导的急性肝损伤模型鼠。2.2 TGF-β1及Smad3在CCl4诱导小鼠急性肝损伤时的表达变化实验结果显示,与橄榄油对照小鼠比较,C Cl4肝损伤模型鼠血清及肝组织匀浆中T GF-β1水平升高,3天时达到高峰;CCl4肝损伤模型鼠肝组织中T GF-β1、TβRII、Smad2、Smad3及Smad4 m RNA表达水平均明显高于橄榄油对照鼠;Western blotting结果显示,CCl4肝损伤模型鼠肝组织S mad3及磷酸化Smad3（p-Smad3）蛋白水平也明显升高。上述结果表明,CCl4肝损伤模型鼠出现肝损伤时T GF-β1及其信号分子Smad3在m RNA转录及蛋白水平均出现异常表达。2.3 Smad3过表达对CCl4所致急性肝损伤的影响2.3.1 pc DNA3-Smad3表达质粒对小鼠肝脏Smad3表达的影响实验通过小鼠尾静脉注射L ipofectamine 2000包裹的pc DNA3-Smad3表达质粒,观察S mad3在小鼠肝脏的表达。RT-PCR结果显示,注射pc DNA3-Smad3表达质粒小鼠肝组织S mad3 m RNA水平明显高于注射pc DNA3空质粒小鼠;Western blotting及免疫组织化学染色结果进一步显示,注射pc DNA3-Smad3表达质粒小鼠肝组织S mad3蛋白水平也明显高于注射pc DNA3空质粒小鼠。上述结果表明,实验成功制备了肝脏S mad3过表达模型鼠。2.3.2 Smad3过表达对CCl4诱导的小鼠急性肝损伤的影响血清转氨酶水平检测结果表明,与C Cl4处理的空质粒对照小鼠相比,C Cl4处理的的S mad3过表达小鼠血清ALT及AST水平于1天及3天均明显升高。H&E染色显示,与CCl4处理1天的的空质粒对照鼠比较,CCl4处理1天的Smad3过表达鼠肝组织坏死面积、肝门脉及汇管区周围环状坏死病灶没有明显差异。CCl4处理3天及5天的空质粒对照鼠肝门脉及汇管区周围环状坏死面积减小,而C Cl4处理3天及5天的Smad3过表达鼠仍有大面积坏死。上述结果证实,Smad3过表达加重了CCl4所致急性肝损伤。2.3.3 Smad3过表达对肝脏巨噬细胞和中性粒细胞数量及肝细胞凋亡的影响肝损伤后继发的炎症反应,可以进一步加重肝损伤。本研究采用流式细胞术检测肝组织中巨噬细胞及中性粒细胞数量。研究结果显示,C Cl4处理的S mad3过表达小鼠肝组织中巨噬细胞及中性粒细胞数量,均明显高于C Cl4处理的空质粒对照小鼠。巨噬细胞及中性粒细胞均能分泌炎性细胞因子,因此,研究还检测了血清I L-1β及IL-6水平变化,结果显示,CCl4处理的S mad3过表达小鼠血清I L-1β及IL-6水平,明显高于CCl4处理的空质粒对照小鼠。T UNEL染色结果显示,与C Cl4处理的空质粒对照鼠比较,C Cl4处理的S mad3过表达鼠肝细胞凋亡数量明显增多,同时可见凋亡相关蛋白B ax、Bcl-2、Cyt C及活性Caspase3蛋白水平也明显升高,Bax与Bcl-2比值增加。上述结果提示,Smad3过表达可能通过增加C Cl4模型鼠炎性细胞浸润、释放炎性细胞因子以及促进肝细胞凋亡,进而加重肝损伤,阻止肝脏修复。2.4 Smad3 sh RNA对CCl4诱导的小鼠急性肝损伤的影响2.4.1 Smad3 sh RNA对小鼠肝脏Smad3表达的影响小鼠尾静脉注射p GCsi-U6/Neo-Smad3 sh RNA表达质粒,观察小鼠肝脏Smad3表达。RT-PCR结果显示,注射p GCsi-U6/Neo-Smad3 sh RNA表达质粒小鼠肝组织S mad3 m RNA表达水平明显低于注射p GCsi-U6/Neo空质粒小鼠。Western blotting结果显示,注射p GCsi-U6/Neo-Smad3 sh RNA小鼠肝组织Smad3蛋白表达水平也明显低于注射空质粒小鼠。免疫组织化学染色结果进一步显示S mad3sh RNA小鼠肝细胞Smad3蛋白表达下降。上述结果表明,实验利用Smad3 sh RNA成功敲低了小鼠肝脏S mad3基因表达。2.4.2 Smad3 sh RNA对CCl4模型鼠急性肝损伤影响血清转氨酶水平检测结果表明,与C Cl4处理的空质粒对照鼠比较,C Cl4处理的S mad3 sh RNA小鼠,血清ALT及AST水平均明显降低;H&E染色结果显示,与C Cl4处理的空质粒对照鼠相比,C Cl4处理的S mad3 sh RNA小鼠肝组织坏死面积明显减小。上述结果提示,肝脏S mad3敲低对CCl4模型鼠肝脏具有保护作用。2.4.3 Smad3 sh RNA对肝脏巨噬细胞和中性粒细胞数量以及肝细胞凋亡的影响流式细胞术检测结果显示,C Cl4处理的S mad3 sh RNA小鼠肝组织巨噬细胞、中性粒细胞及N KT细胞数量,均明显低于CCl4处理的空质粒对照鼠。C Cl4处理的S mad3 sh RNA小鼠血清IL-1β及IL-6水平也明显低于对照鼠。TUNEL染色结果显示,与C Cl4处理的空质粒对照鼠相比,C Cl4处理的S mad3 sh RNA小鼠肝细胞凋亡数量明显减少;与C Cl4处理的空质粒对照鼠比较,C Cl4处理的Smad3 sh RNA小鼠,不仅p-Smad3蛋白水平降低,Bax、Cyt C及Cleaved caspase3蛋白水平也明显下降。上述结果提示,S mad3 sh RNA可能通过抑制CCl4小鼠肝脏炎性细胞浸润、炎性细胞因子释放以及肝细胞凋亡,进而减轻肝损伤,有利于肝脏修复。3结论综上所述,T GF-β1及Smad3在CCl4所致急性肝损伤小鼠肝组织高表达,肝脏S mad3过表达可以加重CCl4所致的小鼠急性肝损伤,抑制肝细胞S mad3表达可以减轻C Cl4所致的小鼠急性肝损伤;S mad3过表达可以加重小鼠肝组织巨噬细胞及中性粒细胞等固有免疫细胞浸润,促进炎性细胞因子I L-1β及IL-6分泌,同时通过线粒体凋亡途径促进肝细胞凋亡,进而引起继发性肝损伤以及阻止肝组织修复。另外,基因敲除（K nock out）在验证Smad3机制方面具有重要意义,但该方法不能应用于临床,而本研究构建的S mad3 sh RNA表达质粒,可以通过静脉给药,在体内敲减S mad3基因表达,因此具有临床应用前景。本实验证明S mad3 sh RNA对小鼠肝脏具有保护作用,提示Smad3 sh RNA具有治疗肝损伤疾病的潜能。