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目的:1.研究不同时间、不同浓度的表皮生长因子(EGF)刺激对非小细胞肺癌细胞(A549、H1299)中RFPL3、hTERT蛋白的影响,并筛选出刺激的最佳浓度和最佳时间。2.研究EGF刺激引起非小细胞肺癌细胞(A549、H1299)中RFPL3、hTERT蛋白的表达变化是否与MEK信号传导通路有关;3.研究RFPL3、hTERT蛋白与MEK信号传导通路中相关蛋白表达变化的关系;4.通过以上实验,有望为晚期肺癌的分子靶向治疗提供可能的新的靶点。方法:1.以A549、H1299细胞为实验对象,加入不同浓度的EGF刺激24h、48h,通过RT-PCR及Western blot技术分别从mRNA和蛋白水平检测RFPL3、hTERT蛋白的表达;2.MTT法检测EGF对A549、H1299细胞活力的影响,流式细胞学技术检测细胞凋亡情况;3.加入EGFR抑制剂(AG1478、Erlotinib)预处理细胞4h,再加入EGF刺激48h,设置对照组,通过Western blot检测RFPL3、hTERT蛋白的表达;4.应用MEK通路特异性抑制剂(PD98059)预处理细胞2h,再加入EGF刺激48h,设置对照组,通过Western blot检测相关蛋白的表达;5.分别向两种肺癌细胞中转染RFPL3过表达质粒,48h后提取总蛋白,Western blot检测相关蛋白的表达。结果:1.EGF可上调NSCLC细胞中RFPL3、hTERT蛋白的表达,并在一定浓度范围内呈时间、浓度依赖性,20ng/ml、48h为最佳刺激浓度和最佳时间;2.EGF可促进NSCLC细胞的增殖,在一定浓度范围(<20ng/ml)内,EGF的浓度增加,细胞活力随之增加,细胞凋亡减少;3.加入EGFR抑制剂(AG1478、Erlotinib)后,A549、H1299细胞中RFPL3、hTERT蛋白的表达降低,进一步表明EGF可上调RFPL3、hTERT蛋白的表达;4.加入MEK信号通路抑制剂(PD98059)后,总ERK蛋白表达不变,p-ERK蛋白表达明显下降,MEK信号通路被激活;RFPL3、hTERT蛋白的表达亦下降,表明EGF上调A549、H1299细胞中RFPL3、hTERT蛋白表达的作用可能与MEK信号通路密切相关;5.成功转染RFPL3过表达质粒后,hTERT蛋白表达增加,MEK信号通路相关蛋白(Ras、Raf、ERK、p-ERK蛋白)表达增加。结论:EGF与细胞膜上EGFR结合,激活MEK信号通路,使MEK信号通路中的上游分子Ras、Raf蛋白表达增加,ERK表达亦增加,调控肿瘤蛋白RFPL3表达增加。RFPL3可增强hTERT启动子的转录活性,促进hTERT的转录和表达,从而使端粒酶活性增强,使肿瘤细胞得以无限增殖。