哺乳动物第一次胚层分化发生在囊胚腔形成过程中。囊胚形成前,胚胎由一个全能的受精卵分裂形成多个发育潜力几乎相同的卵裂球。随后胚胎的形态会发生显著改变,形成一个空腔,同时卵裂球也会分化形成外层的滋养层细胞(Trophectoderm,TE)和内部的内细胞团细胞(Inner cell mass,ICM)。这两种细胞进一步的发育走向不同,滋养层会成为胎盘部分,而内细胞团成为胎体和少部分胎盘组织。尽管小鼠中TE与ICM分化的进程和分子机理已经得到清晰的阐述,但在其他哺乳动物中却知之甚少。最近一些研究结果表明,猪中TE与ICM分化的相关事件与小鼠中存在差异,这说明小鼠TE与ICM的分化模式并不能代表所有哺乳动物。在小鼠中TE与ICM的分化依赖于转录因子CDX2与OCT4的相互抑制作用。CDX2最初在小鼠桑椹胚部分卵裂求中开始表达,并逐渐在部分外部细胞中富集,最终在囊胚TE中特异性表达。与此相反,OCT4在所有小鼠早期所有卵裂球中均表达,直至囊胚期,OCT4逐渐向ICM中富集,并最终在ICM中特异性表达。在TE细胞中,OCT4直接受到CDX2转录水平的抑制,而ICM中由于没有CDX2的表达,OCT4可以正常表达。有报道表明,小鼠中CDX2受到YAP-TEAD转录共激活因子的调控,而YAP的活性受到其上游信号通路Hippo和ROCK的调控。而猪中的相关研究结果表明,虽然CDX2在TE细胞中特异性表达,但是OCT4即使在晚期孵化囊胚中还仍然在TE和ICM中广泛表达。这两个因子如此长时间的共表达于TE细胞说明CDX2不能够高效的抑制OCT4的表达,OCT4也不是一个对于滋养层分化反映敏感的转录因子。这说明在猪中TE与ICM分化的分子基础可能与小鼠不同。更为重要的是,目前猪TE与ICM分化的进程没有得到清晰的阐述,滋养层与内细胞团特异性因子也不清楚。这些基础信息的未知极大阻碍了进一步研究猪滋养层与内细胞团分化的分子机理。为此,我们首先对猪滋养层和内细胞团标记因子进行了筛选,通过免疫荧光追踪CDX2在猪体内和体外胚胎中的表达模式发现虽然CDX2在猪滋养层细胞中特异性表达,但是CDX2在猪囊胚期才开始表达,这在发育时程上晚于小鼠(桑椹胚期开始表达),说明滋养层分化的调控机理或者关键事件在猪与小鼠中可能不同。之后我们通过免疫荧光的方法筛选了在猪内细胞团中特异性表达的因子,结果发现,SOX2特异性的在猪胚胎部分、内细胞团和上胚层中表达,并且与CDX2呈现互斥的表达模式,这些结果说明SOX2是猪早期胚胎多潜能特异标记因子。根据这些因子的表达,与小鼠已有资料对比,我们总结了猪早期胚胎发育过程中的多个转录因子表达时程,首次系统的揭示了猪特有的滋养层与内细胞团分化的分子基础和特有的胚层分化进程。已有报道显示FBS可以促进猪体外囊胚孵化,提高体外囊胚细胞数,但FBS是成分不明确的混合物质,且以往由于没有明确的分子标记可以反应猪ICM和TE细胞,无法准确FBS对猪胚胎发育的影响。这不但大大限制了FBS在猪体外培养过程的应用,也限制了猪体外培养优化相关研究工作的进展。而本文在揭示了猪滋养层与内细胞团分化分子基础之后利用CDX2和SOX2分别标记猪滋养层与内细胞团细胞,进一步评价了FBS对于猪早期胚胎发育胚层分化的影响,结果显示,FBS可以提高猪体外胚胎囊胚孵化率和细胞数,同时CDX2和SOX2免疫荧光结果显示,FBS可以提高猪内细胞团细胞数,内细胞团细胞比例以及内细胞团进一步分化的能力。由此我们明确了FBS在改善猪体外胚胎培养体系中的价值,为我们下一步体外获得发育进程更加接近体内的胚胎提供了重要线索。之前我们的结果发现CDX2在猪胚胎中起始表达晚于小鼠,为此我们系统地比较了猪与小鼠相同细胞数的胚胎中CDX2的表达情况,结果发现CDX2在猪囊胚期开始表达,而小鼠桑葚胚期便已开始表达。因此我们进一步检测了CDX2上游调控因子YAP的表达,发现YAP的核定位与CDX2表达同时发生,同时利用Y27632阻断ROCK通路进而抑制YAP入核也会抑制CDX2的表达,这说明猪中同小鼠一样CDX2的表达受ROCK-YAP通路调控。由于有报道显示ROCK通路通过与细胞极性互作来调控YAP入核和CDX2表达,我们也检测了猪胚胎极化的进程。免疫荧光检测极性蛋白P-EZRIN表达的结果显示,与小鼠相比,猪胚胎细胞极化时间发生在桑椹胚期,晚于小鼠(8-细胞期开始),此外只有部分猪桑椹胚和早期囊胚外层卵裂球发生极化,而小鼠中几乎所有外层卵裂球此发育阶段均已发生极化。这些结果说明,猪中CDX2起始表达晚于小鼠可能是由于极化这一胚层分化重要前提事件在猪中的进程与小鼠中不同,这为我们进一步研究猪特有的胚层分化机理奠定了理论基础。由于之前我们的结果表明OCT4和CDX2长时间共同表达于猪滋养层中,这可能说明OCT4和CDX2在猪早期胚胎中的互作方式及猪中滋养层与内细胞团分化的分子机制与小鼠中存在不同。为此,我们以猪卵裂期胚胎为研究对象进一步研究了CDX2和OCT4在猪早期胚胎中的作用方式。结果显示早期胚胎中CDX2的过表达会导致猪胚胎发育阻滞,而这种阻滞可以通过过表达OCT4来挽救,这说明CDX2的过表达是通过抑制OCT4的表达或者功能导致的胚胎发育阻滞。进一步研究发现早期胚胎中CDX2的过表达不会影响OCT4转录及翻译水平,而会在翻译后水平通过竞争机制抑制OCT4与DNA的可触性,从而促进OCT4出核降解。而这种作用模式与小鼠中已有的CDX2与OCT4直接相互抑制彼此表达的研究结果有所不同,为我们进一步研究猪胚层分化过程中CDX2与OCT4的互作模式提供了研究基础。这些研究结果发现了猪特有的胚层分化进程及分子基础,补充了我们对哺乳动物胚层分化模式的了解,也为进一步研究猪早期胚胎胚层分化机理提供的大量的研究依据和理论基础。