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骨肉瘤(Osteosarcoma)是骨科最常见的原发恶性肿瘤,恶性程度高,预后差。采用新辅助化疗后骨肉瘤患者的5年生存率上升到70%左右,但近20年来一直处于平台期,再没有明显的提高。因此,目前临床上迫切的需要一种更为安全、有效,能够克服化疗的耐药等缺点的骨肉瘤辅助治疗方式。光动力疗法(photodynamic therapy, PDT)是通过局部或全身性注射特定的光敏剂(photosensitizer),随着光敏剂选择性地聚集于病变部位后使用适当波长的可见光对病变的部位进行照射,通过光、光敏剂和有氧分子在治疗部位或病灶区产生的联合作用引发的生物杀伤效应而实现其治疗作用。5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)及其脂类衍生物是目前PDT领域中的研究热点之一。5-ALA在皮肤癌、食道癌、胃肠道癌及肺癌等领域已经研究相当广泛,并且已经有相当程度的临床应用。而5-ALA介导的PDT在骨肉瘤领域目前尚无系统的应用研究。本课题欲从体外、体内以及杀伤机制等多个方面探讨5-ALA-PDT应用于骨肉瘤治疗中的可能性。第一部分5-ALA-PDT对体外培养骨肉瘤细胞的杀伤效果研究[目的]探讨5-ALA在骨肉瘤细胞中代谢合成PpⅨ的规律,5-ALA对于骨肉瘤细胞的暗毒性,单纯激光照射对于骨肉瘤细胞生长的影响,5-ALA-PDT在体外环境中对骨肉瘤细胞杀伤效果的检测以及最佳作用参数等。[方法]1荧光显微镜观察5-ALA作用于MG-63、LM8细胞后PpⅨ的产生情况；2荧光分光光度法检测5-ALA作用于MG-63、LM8细胞后随5-ALA的浓度不同、5-ALA的孵育时间不同以及细胞浓度不同时PpⅨ的产生规律；3 MTT法检测5-ALA对于MG-63、LM8细胞的暗毒性,单纯激光照射对于MG-63、LM8细胞生长的影响,以及5-ALA-PDT对于MG-63、LM8细胞的杀伤效果及最佳5-ALA浓度、最佳5-ALA孵育时间、最佳光照剂量等作用参数；4倒置相差显微镜、细胞爬片HE染色、透射电镜观察5-ALA-PDT作用于MG-63、LM8细胞后细胞形态学变化。[结果]1 5-ALA作用于MG-63、LM8细胞后经荧光显微镜在409 nm左右的荧光激发后可以观察到PpⅨ产生的红色荧光,显示PpⅨ主要产生于胞质和胞核中,随着5-ALA浓度的增强,可使整个细胞均显示出红色荧光；2荧光分光光度计检测结果显示5-ALA作用于MG-63、LM8细胞后PpⅨ的产量随5-ALA的浓度、5-ALA的作用时间以及细胞浓度的升高而增加,当5-ALA浓度达到2 mM,作用时间达到8 h后PpⅨ产量增加的幅度逐渐放缓；3 MTT检测表明：对于MG-63、LM8细胞,单纯使用较小剂量的5-ALA(0.25mM-8mM),或单纯使用较小剂量的激光照射(能量密度5 J/cm2-80J/cm2),在12h以内对MG-63、LM8细胞的生长无显著性影响(p>0.05)；5-ALA-PDT作用于MG-63、LM8细胞时,与对照组相比有显著的杀伤效果(p<0.05),细胞的杀伤率随着5-ALA浓度的增加、激光照射剂量的增加以及5-ALA孵育时间的延长而升高,当5-ALA浓度达到4 mM,激光剂量达到60 J/cm2,5-ALA孵育时间达到10 h以后细胞杀伤率不再有显著性变化(p>0.05)。4倒置相差显微镜下观察可见MG-63、LM8细胞经5-ALA-PDT作用后细胞大多数凋亡、崩解、坏死,从而脱壁漂浮,细胞结构不清,失去原有形态；细胞爬片HE染色可见绝大多数细胞凋亡,边缘不清,胞核固缩,正常结构不复存在；透射电镜观察可见胞体皱缩,线粒体肿胀,内质网扩张、肿胀,胞浆呈大量空泡样改变。可见凋亡小体,即呈颗粒、块状、无结构的致密染色质凝集分布在核膜内侧,细胞核固缩。[结论]15-ALA作用于MG-63、LM8细胞后可高效率的产生PpⅨ,产生的PpⅨ主要存在于胞质和胞核中；2单纯使用5-ALA,单纯使用激光照射对MG-63、LM8细胞的生长无明显影响；5-ALA-PDT对于MG-63、LM8细胞有显著的杀伤效果,杀伤效果随5.ALA浓度、激光剂量、5-ALA孵育时间的升高而增加；细胞形态学观察可见5-ALA-PDT通过诱导细胞凋亡或直接导致细胞坏死来杀伤骨肉瘤细胞。第二部分5-ALA-PDT对小鼠骨肉瘤模型的体内抑瘤效果研究[目的]建立C3H小鼠骨肉瘤模型,通过尾静脉注射给药的方式探讨5-ALA在小鼠肿瘤及正常组织中的代谢情况,观察不同剂量5-ALA-PDT对小鼠骨肉瘤的体内抑瘤效果以及对小鼠骨肉瘤肺转移的影响。[方法]1通过C3H小鼠背部皮下注射LM8细胞的方法建立小鼠骨肉瘤模型；2小鼠尾静脉注射5-ALA后,通过荧光分光光度法检测注射后不同时间段肿瘤及正常组织中PpⅨ的产生代谢情况；3当肿瘤直径达到0.6 cm-0.8 cm时,将小鼠随机分为空白对照组、单纯5-ALA注射组、单纯激光照射组、5-ALA低剂量PDT组(50 mg/kg)、5-ALA中剂量PDT组(100mg/kg)、5-ALA高剂量PDT组(150mg/kg),每组8只,分别进行相应处理；4分别于处理后1、3、7、10、14天使用游标卡尺测量肿瘤直径,计算肿瘤体积,并于末次测量后处死小鼠,剥离肿瘤组织称重；5将各组小鼠肿瘤组织及肺组织制作病理切片,进行病理学检查并观察肿瘤肺转移情况。[结果]1以1×107个LM8细胞注射于C3H小鼠背部皮下,可以成功建立小鼠骨肉瘤模型,成瘤率约97.5%。大约在接种后14天,肿瘤结节最大直径达到0.6 cm-0.8 cm；2小鼠尾静脉注射5-ALA后,经荧光分光光度计检测结果显示PpⅨ在肿瘤组织、瘤旁组织、心、肺、肝、肾脏中均有产生,其中在肝脏中的量最高,其次是肿瘤组织中,而在瘤旁组织、心、肺、肾脏中较少。在瘤旁组织及脏器中,注射5-ALA后4-6h PpⅨ产量达到最高,其后逐渐下降。而在肿瘤组织中,注射后8 h PpⅨ产量达到高峰；3 PDT处理后第1、3、7、10、14天实验组与对照组肿瘤体积均有显著性差异(p<0.05)；对照组中空白对照组与单纯5-ALA注射组、单纯激光照射组之间肿瘤体积均无显著性差异(p>0.05)；实验组中5-ALA低剂量组与中、高剂量组之间肿瘤体积亦有显著性差异(p<0.05),而5-ALA中剂量组与高剂量组之间肿瘤体积无显著性差异(p>0.05)。第14天剥离肿瘤称重显示实验组与对照组之间肿瘤重量有显著性差异(p<0.05)。空白对照组与单纯5-ALA注射组、单纯激光照射组之间肿瘤重量无显著性差异(p>0.05)；实验组5-ALA低剂量组与中、高剂量组肿瘤重量有显著性差异(p<0.05),而中、高剂量组之间肿瘤重量无显著性差异(p>0.05)；4病理切片HE染色可见实验组中PDT低剂量组可见片状坏死区域明显增多,中、剂量组可见大片细胞凝固性坏死及退化、变性,细胞核固缩。甚至只残留核形,而无苏木精着色。肺组织病理检测显示空白对照组、单纯5-ALA组、单纯照光组小鼠绝大多数均出现肺转移,实验组中PDT低剂量组部分小鼠可见肺转移灶,而中、高剂量组大多数小鼠均未见明显肺转移灶,且与空白对照组之间转移率均有显著性差异(p<0.05)。[结论]1 C3H小鼠骨肉瘤模型建立成功；2小鼠尾静脉注射5-ALA后,PpⅨ主要产生于肿瘤组织和肝脏中,在肿瘤组织中,注射后8h PpⅨ产量达到高峰。3单纯5-ALA注射或单纯激光照射对小鼠骨肉瘤无明显抑制作用；5-ALA-PDT可以对小鼠骨肉瘤产生显著的体内抑瘤效果和抑制肺转移效果,其中5-ALA中、高剂量组的抑瘤效果高于低剂量组。第三部分5-ALA-PDT对骨肉瘤杀伤机制的初步探讨[目的]初步探讨5-ALA-PDT杀伤骨肉瘤的作用机制和途径[方法]1 Annexin-V-FITC/PI双标记结合流式细胞仪检测5-ALA-PDT后MG-63、LM8细胞凋亡情况；2 EnVision免疫组化染色法观察空白对照组、单纯5-ALA注射组、单纯激光照射组、5-ALA-PDT (?)低、中、高剂量组小鼠肿瘤组织细胞增殖相关蛋白PCNA、Ki-67,血管生成相关蛋白VEGF以及凋亡相关蛋白Bax, Bcl-2的表达情况。[结果]1 MG-63、LM8细胞经5-ALA-PDT处理后细胞以凋亡为主,其凋亡率和坏死率均较对照组显著提高(p<0.05)；2可见PCNA、Ki-67定位于细胞核,VEGF、Bax, Bcl-2定位于细胞浆。PCNA、Ki-67、VEGF、Bcl-2在空白对照组、单纯5-ALA注射组、单纯激光照射组、5-ALA-PDT低剂量组中阳性率为(++),而在5-ALA-PDT中、高剂量组中为(+)；Bax在空白对照组、单纯5-ALA注射组、单纯激光照射组、5-ALA-PDT低剂量组中阳性率为(+),而在5-ALA-PDT中、高剂量组中为(+-++)。[结论]1 5-ALA-PDT既可以诱导骨肉瘤细胞凋亡,也可以直接杀伤骨肉瘤细胞,其中以诱导凋亡为主；2 5-ALA-PDT抑制骨肉瘤生长的机制可能与抑制骨肉瘤细胞增殖、抑制血管生成以及促进凋亡等有关,但需要进一步扩大样本数量,增加不同时间段的肿瘤组织取材,并采用分子生物学等精确方法更好的观察和验证其机制。