研究背景及目的:结直肠癌（Colorectal Cancer,CRC）是全球因癌症致死的主要原因之一,仅在2018年就出现了1,096,601例新发病例和551,269例死亡病例。与结直肠癌发生发展相关的高危因素众多,包括肥胖,高脂饮食,以及感染其他疾病（例如病毒感染）等。近年来,一些研究人员专注于某些病毒的感染在结直肠癌发生发展中的潜在作用,例如人乳头瘤病毒,人多瘤病毒和人疱疹病毒等。这些研究表明病毒感染在结直肠癌的发展中可能起到了一定的作用。然而,其具体的分子机制仍然不清楚。EB病毒（Epstein-Barr Virus,EBV）是一种公认的致癌病毒,目前感染了全球90%以上的人口,并且是国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer,IARC）确定的第一种病毒致癌物。除可以引起上皮疱疹外,它还被证明与伯基特淋巴瘤（Burkitt’s Lymphoma,BL）,鼻咽癌（Nasopharyngeal Carcinoma,NPC）,胃癌（Gastric Cancer,GC）等癌症有关,并且大多数EB病毒相关癌症的发生均与EB病毒的潜伏期感染相关。EB病毒感染是否处于潜伏期取决于被感染细胞膜表面蛋白表达的差异,并且潜伏感染的EB病毒也具有一定的转录活性。BART（Bam HI-A rightward transcripts）和EB病毒编码的RNA（EBV-Encoded RNA,EBER）是潜伏感染中表达最广泛的基因。目前的研究集中在诸如EBNA等EB病毒编码的m RNA上,该基因编码并表达了包括LMP1（Latent infection integral membrane protein-1）,LMP2A（Latent infection integral membrane protein-2A）和LMP2B（Latent infection integral membrane protein-2B）在内的潜在膜蛋白。但是,EB病毒相关癌症的发生发展不仅受病毒编码的蛋白质调控,EB病毒编码的miRNA（EBV-miRs）在此过程中也发挥着不可或缺的作用。miRNA（MicroRNA）是一种包含17-23个核苷酸的非编码单链RNA。目前共发现25种EB病毒编码的miRNA前体及其相应的48个成熟miRNA。大多数成熟的miRNA位于EB病毒基因组的BART区域,该区域共编码包括EBV-miR-BART1至BART22在内的22个miRNA前体,并且可以产生44个成熟的miRNA。有研究指出EBV-miR-BARTs在胃癌和鼻咽癌组织中高表达,并通过发挥病毒潜伏和免疫逃逸的作用促进肿瘤的发展,但在结直肠癌领域缺乏相关研究。本课题通过对EB病毒编码的miRNA,EBV-miR-BART18-3p进行研究,探索其调控结直肠癌发展的潜在分子机制。研究方法:1结直肠癌患者组织miRNA表达谱的构建与分析1.1选用6例术前均未经过放化疗治疗的结直肠癌患者结直肠癌组织及对应的癌旁正常组织,6例结直肠腺瘤患者瘤组织进行miRNA microarray测序分析,筛选出在结直肠癌组织中表达显著增加的EB病毒编码的miRNA,EBV-miR-BART18-3p作为进一步研究的对象。收集经病理诊断确诊的403例结直肠癌患者结直肠癌组织及癌旁正常组织,采用RT-qPCR实验进一步在组织RNA中验证EBV-miR-BART18-3p的表达水平,并通过受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve,ROC）计算曲线下面积（area under the curve,AUC）来判断组织中EBV-miR-BART18-3p表达水平对结直肠癌辅助诊断的潜在效力。1.2利用原位杂交技术在具有10年随访资料的1,078例结直肠癌患者组织芯片（tissue microarrays,TMA）中检测EBV-miR-BART18-3p的表达水平。通过多因素Cox回归模型分析对影响结直肠癌患者预后以及生存时间的因素（性别、年龄、肿瘤的位置、肿瘤分级、TNM分期以及EBV-miR-BART18-3p的表达水平）进行风险评估,利用生存分析研究EBV-miR-BART18-3p的表达水平对结直肠癌患者生存时间的影响,从而探讨EBV-miR-BART18-3p的表达与结直肠癌发展的关系。2 EBV-miR-BART18-3p在结直肠癌发展中的功能研究2.1利用RT-qPCR技术对9种常见结直肠癌细胞株（CT26、DLD-1、HCT-15、HCT116、HT-29、Lo Vo、RKO、SW480、SW620）和人正常肠上皮细胞株NCM460中EBV-miR-BART18-3p的表达水平进行检测。对结直肠癌细胞进行缺氧处理,利用RT-qPCR技术检测缺氧对EBV-miR-BART18-3p表达水平的影响,利用原位杂交和荧光原位杂交技术检测结直肠癌细胞中EBV-miR-BART18-3p的表达以及亚细胞定位。2.2分别构建EBV-miR-BART18-3p KD（Knockdown）SW480,EBV-miR-BART18-3p KD RKO,EBV-miR-BART18-3p OEX（Overexpression）DLD-1,EBV-miR-BART18-3p OEX SW620细胞株。利用Transwell实验对构建的CRC细胞株及其对应的NC（Negative Control）细胞的侵袭与迁移能力进行检测。此外,利用上述细胞株构建裸鼠荷瘤模型,研究EBV-miR-BART18-3p的表达水平对结直肠癌组织生长的影响。同时,利用酶标仪检测裸鼠荷瘤模型中肝、肺组织匀浆的荧光强度,分析结直肠癌细胞中EBV-miR-BART18-3p的表达水平对结直肠癌细胞肿瘤转移能力的影响。3 EBV-miR-BART18-3p促进结直肠癌发展的关键信号通路研究3.1构建包含以及不包括外源性miRNA的结直肠癌患者组织差异表达miRNA和m RNA的WGCNA（Weighted Gene Co-Expression Network Analysis）调控网络,并对模块中的基因进行KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析,发掘EBV-miR-BART18-3p调控结直肠癌发展的下游关键分子及通路（参与HIF-1α（Hypoxia Inducible Factor 1 Subunit Alpha）通路的LDHA（Lactate Dehydrogenase A））。同时,利用上述1.2中介绍的结直肠癌患者组织芯片及收集到的患者10年生存随访信息,通过多因素Cox回归模型分析对影响结直肠癌患者预后以及生存时间的因素（性别、年龄、肿瘤的位置、肿瘤分级、TNM分期以及下游分子LDHA的表达水平）进行风险评估,利用生存分析研究下游分子（LDHA）的表达水平对结直肠癌患者生存时间的影响,以此研究下游分子（LDHA）的表达与结直肠癌发展的关系。3.2利用RT-qPCR和蛋白免疫印迹检测结直肠癌细胞中上述发现的关键分子（LDHA,HIF-1α）的表达水平以及EBV-miR-BART18-3p与其的调控关系。利用生物信息学分析预测EBV-miR-BART18-3p潜在的下游靶基因,并构建潜在靶基因结合位点突变的双荧光素酶报告基因质粒,通过双荧光素酶报告基因实验验证其结合和调控作用。通过RT-qPCR、蛋白免疫印迹和染色质免疫共沉淀实验（Chromatin Immunoprecipitation Assay,Ch IP）验证EBV-miR-BART18-3p、靶基因（SIRT1）以及下游关键分子LDHA和HIF-1α之间的调控关系。利用检测细胞内外乳酸,以及液相色谱—二级质谱联用仪13C同位素示踪试验研究EBV-miR-BART18-3p的表达水平对细胞代谢过程的影响。3.3利用转录组高通量测序技术以及KEGG通路富集分析挖掘LDHA NC和KD SW480细胞中参与结直肠癌发展的EBV-miR-BART18-3p/SIRT1/HIF-1α/LDHA的下游基因,利用RT-qPCR和蛋白免疫印迹检测结直肠癌细胞中上述发现的下游基因（FASN）的表达水平以及EBV-miR-BART18-3p、LDHA与其的调控关系。利用上述1.2中介绍的结直肠癌患者组织芯片及收集到的患者10年生存随访信息,通过多因素Cox回归模型分析对影响结直肠癌患者预后以及生存时间的因素（性别、年龄、肿瘤的位置、肿瘤分级、TNM分期以及下游分子FASN的表达水平）进行风险评估,利用生存分析研究下游分子FASN的表达水平对结直肠癌患者生存时间的影响以及与结直肠癌发展的关系。通过DNA Pull-Down以及蛋白免疫印迹实验研究EBV-miR-BART18-3p调控FASN表达的相关机制,并检测各结直肠癌细胞中脂质及甘油三酯的含量,从而研究EBV-miR-BART18-3p、FASN的表达水平以及肿瘤缺氧微环境对细胞脂肪新生的影响。4 EBV-miR-BART18-3p应用于结直肠癌辅助诊断的初步探索4.1利用课题组前期构建的人源肿瘤异种移植模型（Patient-Derived tumor Xenograft,PDX模型）建立PDX Antagomir-EBV-miR-BART18-3p小鼠模型,检测分析EBV-miR-BART18-3p表达水平对肿瘤生长、小鼠生存时间等是否存在影响,采用HE染色观察EBV-miR-BART18-3p表达水平改变对肿瘤组织病理结构的影响,采用原位杂交、免疫组织化学染色检测小鼠模型肿瘤组织中EBV-miR-BART18-3p、LDHA、FASN、肿瘤恶性表型标志物（Ki67）的蛋白表达水平。同时检测肿瘤组织单细胞悬液中的脂质以及甘油三酯含量,分析EBV-miR-BART18-3p的表达在结直肠癌发展中的生物学功能。4.2利用EB病毒ELISA检测试剂盒检测结直肠癌患者与健康人群中EB病毒感染率及EB病毒滴度是否存在差异,通过Matched Case-Control Power Analysis分析结果确定本实验所需的检测例数。同时提取结直肠癌患者血清总RNA,利用RT-qPCR方法检测结直肠癌患者及年龄性别匹配的健康对照人群血清中EBV-miR-BART18-3p的表达水平,通过分层分析发现不同TNM分期的结直肠癌患者血清中EBV-miR-BART18-3p的表达水平差异,利用受试者工作特征曲线（ROC）计算曲线下面积（AUC）来判断血清EBV-miR-BART18-3p的表达水平在结直肠癌中潜在的辅助诊断价值。研究成果:1结直肠癌组织miRNA表达谱特征分析1.1结直肠癌患者组织miRNA差异表达分析miRNA microarray数据显示EB病毒编码的miRNA,EBV-miR-BART18-3p在结直肠癌癌组织中表达水平与腺瘤、癌旁正常组织相比显著增加,而人群样本验证的结果也证明了EBV-miR-BART18-3p在结直肠癌组织中高表达,且差异有统计学意义（P＜0.001）。ROC曲线的结果显示,EBV-miR-BART18-3p单独诊断结直肠癌的AUC值在Testing样本、Validation样本和Combined样本中分别为0.8036、0.8208和0.8066,且有统计学意义（P＜0.0001）,表明肿瘤组织中EBV-miR-BART18-3p的表达水平对结直肠癌的辅助诊断具有一定的潜在效力。1.2 EBV-miR-BART18-3p表达水平与结直肠癌发病风险研究TMA样本的原位杂交染色结果显示:在Testing样本、Validation样本及Combined样本中,与癌旁正常组织相比,结直肠癌组织中EBV-miR-BART18-3p的表达水平明显较高。结直肠癌组织中EBV-miR-BART18-3p的表达水平同患者的肿瘤分级、是否出现淋巴结转移、是否出现远端转移以及肿瘤TNM分期有关,且差异有统计学意义（P＜0.05）;患者年龄大于55岁、结肠肿瘤、TNM为III/IV期以及高表达的EBV-miR-BART18-3p是影响结直肠癌患者生存时间的危险因素（P＜0.05）;EBV-miR-BART18-3p高表达的结直肠癌患者的生存时间显著减少（P＜0.0001）。而且在TNM分期的各个阶段,患者肿瘤组织中EBV-miR-BART18-3p的表达水平均明显高于癌旁正常组织中的表达水平,且差异均有统计学意义（P＜0.001）,再次提示高表达的EBV-miR-BART18-3p与结直肠癌的病程发展有关。2 EBV-miR-BART18-3p在结直肠癌发展中的功能研究2.1 EBV-miR-BART18-3p在结直肠癌细胞中的表达和功能研究根据9种常见结直肠癌细胞株（CT26、DLD-1、HCT-15、HCT116、HT-29、Lo Vo、RKO、SW480、SW620）和人正常肠上皮细胞株NCM460中EBV-miR-BART18-3p的RT-qPCR结果,我们选取其中EBV-miR-BART18-3p表达水平最高的两个细胞株SW480和RKO,以及EBV-miR-BART18-3p表达水平最低的两个细胞株DLD-1和SW620进行后续实验。缺氧是重要的肿瘤微环境特征,细胞缺氧处理后miRNA原位杂交、荧光原位杂交技术和RT-qPCR结果显示缺氧培养可以显著增加4株细胞中EBV-miR-BART18-3p的表达水平（P＜0.01）;同时EBV-miR-BART18-3p在细胞质和细胞核均有表达,且主要分布在细胞质中。除此之外,缺氧培养可以增加细胞质和细胞核中EBV-miR-BART18-3p的表达水平。2.2 EBV-miR-BART18-3p与结直肠癌发展的相关性研究细胞侵袭与迁移实验结果显示,EBV-miR-BART18-3p表达水平与结直肠癌细胞侵袭和迁移能力正相关（P＜0.05）。而在裸鼠荷瘤模型中,高表达的EBV-miR-BART18-3p可以促进结直肠癌肿瘤的生长以及肝肺转移的发生（P＜0.05）。3 EBV-miR-BART18-3p促进结直肠癌发展的关键信号通路研究3.1 WGCNA网络构建识别EBV-miR-BART18-3p调控结直肠癌发展的关键分子在所构建的包含外源性miRNA的结直肠癌患者组织差异表达miRNA和m RNA的WGCNA网络中,设置样本连接度筛选阈值大于-2.5,软阈值β=22,最终筛选得到10个基因模块。相关性分析结果显示,Turquoise,Yellow,Black模块与结直肠癌发展的相关性最高（Turquoise:cor=0.99,P＜1E-200;Yellow:cor=0.98,P＜1E-200;Black:cor=0.98,P＜8.3E-182）,其中Turquoise与Black模块中基因与结直肠癌发展正相关,Yellow模块中基因与结直肠癌发展负相关。且在已发掘出的所有有效模块中仅包含了4个外源性miRNA:Black模块中包含了EBV-miR-BART18-3p和EBV-miR-BHRF1–3（ME相关系数=0.7,P=0.001）;Red模块中包含了hcmv-miR-US25-2-5p和hcmv-miR-US5-2-3p（ME相关系数=-0.17,P=0.5）。我们将上述miRNA和m RNA数据中的外源性miRNA剔除后,重新构建WGCNA网络,设置样本连接度筛选阈值大于-2.5,软阈值β=23,最终筛选得到39个基因模块。模块分析的结果显示,在包括外源性miRNA的WGCNA分析中包含EBV-miR-BART18-3p,与结直肠癌相关性较高的Black模块中52.5%的基因在本次分析中转移到了与结直肠癌相关性较低的Turquoise模块中（ME相关系数=0.16,P=0.5）。故EBV-miR-BART18-3p所属的Black模块中的基因可能与EBV-miR-BART18-3p调控的结直肠癌的发展过程有关。Black模块基因的通路富集分析结果显示,LDHA在KEGG Pathways结果的Top 10中参与了多个通路的调控过程,例如缺氧诱导因子通路（hypoxia-inducible factor pathway）,HIF-1α转录因子调控网络（HIF-1-alpha transcription factor network）,乳酸发酵-胞质NADH的再氧化（lactate fermentation-reoxidation of cytosolic NADH）。所以LDHA及其参与的HIF-1α相关通路可能与EBV-miR-BART18-3p促进结直肠癌发展的调控过程相关。TMA样本的免疫组织化学染色结果显示:在Testing样本、Validation样本及Combined样本中,与癌旁正常组织相比,结直肠癌组织中LDHA的表达水平明显较高。结直肠癌组织中LDHA的表达水平与患者的肿瘤分级、是否出现淋巴结转移、是否出现远端转移和肿瘤TNM分期有关,且差异有统计学意义（P＜0.05）;患者年龄大于55岁、男性、结肠肿瘤、TNM为III/IV期以及高表达的LDHA是影响结直肠癌患者生存时间的危险因素（P＜0.05）;LDHA高表达的结直肠癌患者的生存时间显著减少（P＜0.0001）。提示高表达的LDHA与结直肠癌的病程发展有关。3.2 EBV-miR-BART18-3p调控LDHA介导的代谢途径对结直肠癌发展的影响及其机制研究Western Blot实验结果显示,在蛋白水平上,缺氧处理的结直肠癌细胞中EBV-miR-BART18-3p的表达可以正向调控HIF-1α、LDHA的表达水平（P＜0.05）。RT-qPCR结果显示,在m RNA水平上,缺氧处理的结直肠癌细胞中EBV-miR-BART18-3p的表达可以正向调控LDHA的表达水平（P＜0.05）,但HIF-1α无差异。荧光素酶报告基因实验发现,多个潜在靶基因中只有SIRT1可以被EBV-miR-BART18-3p负调控。染色质免疫共沉淀实验（Ch IP）发现敲减EBV-miR-BART18-3p的表达后,SIRT1表达水平降低,使得SIRT1对HIF-1α及后续LDHA的抑制作用降低,而SIRT1过表达可以逆转这一过程,验证了EBV-miR-BART18-3p/SIRT1/HIF-1α/LDHA之间的调控关系。乳酸含量检测结果显示,敲除EBV-miR-BART18-3p、LDHA会使结直肠癌细胞内外乳酸含量降低（在细胞中,EBV-miR-BART18-3p组、LDHA组均为P＜0.01;在细胞外,EBV-miR-BART18-3p组P＜0.05,LDHA组P＜0.001）。随后的13C同位素示踪试验中发现,EBV-miR-BART18-3p的表达可以调控代谢,促进乙酰辅酶A的产生。3.3 EBV-miR-BART18-3p调控FASN介导的脂肪新生通路对结直肠癌发展的影响及其机制研究缺氧处理的LDHA NC和KO SW480细胞转录组高通量测序分析结果筛选出LDHA调控的靶基因(Fold change＞1.5,Padj＜0.05),其中5个基因与LDHA的表达水平为负相关,21个基因为正相关。通过KEGG通路富集分析发现,在富集的Top 10通路中FASN参与了其中多个通路的调控过程,如AMPK信号通路（AMPK signaling pathway）,胰岛素信号通路（Insulin signaling pathway）,脂肪酸生物合成（Fatty acid biosynthesis）,脂肪酸代谢（Fatty acid metabolism）,提示FASN可能参与了EBV-miR-BART18-3p/SIRT1/HIF-1α/LDHA调控结直肠癌发展的下游分子调控过程。RT-qPCR和Western Blot实验结果显示,在RNA水平和蛋白水平上,EBV-miR-BART18-3p、LDHA与FASN表达均为正相关关系,且差异有统计学意义（P＜0.05）。TMA样本的免疫组织化学染色结果显示:在Testing样本、Validation样本及Combined样本中,与癌旁正常组织相比,结直肠癌组织中FASN的表达水平明显较高。结直肠癌组织中FASN的表达水平与患者是否出现淋巴结转移、是否出现远端转移和肿瘤TNM分期有关,且差异有统计学意义（P＜0.05）;患者年龄大于55岁、结肠肿瘤、TNM为III/IV期以及高表达的FASN是影响结直肠癌患者生存时间的危险因素（P＜0.05）;FASN高表达的结直肠癌患者的生存时间显著减少（P＜0.0001）。提示高表达的FASN与结直肠癌的病程发展有关。通过DNA Pull-Down和Western Blot实验的结果发现,EBV-miR-BART18-3p表达可以显著增加FASN启动子区域组蛋白H3K9,H3K14和H3K27的乙酰化水平,从而提高FASN的表达水平。进一步检测结直肠癌细胞中脂质以及甘油三酯的含量结果发现,EBV-miR-BART18-3p和FASN的表达升高以及缺氧微环境均可以上调结直肠癌细胞中的脂肪新生过程,促进结直肠癌的发展。4 EBV-miR-BART18-3p应用于结直肠癌辅助诊断的初步探索4.1利用PDX模型研究EBV-miR-BART18-3p在结直肠癌发展中的生物学功能PDX Antagomir-EBV-miR-BART18-3p小鼠模型结果显示Antagomir注射21天后Antagomir-EBV-miR-BART18-3p注射组PDX肿瘤组织体积小于Antagomir-Control注射组,且生存率也显著提高。免疫组化和原位杂交染色结果显示,与Antagomir-Control注射组相比,抑制EBV-miR-BART18-3p表达的Antagomir-EBV-miR-BART18-3p注射组的PDX组织中的EBV-miR-BART18-3p、LDHA、FASN、肿瘤恶性表型标志物Ki67的表达水平显著降低,且有统计学意义（P＜0.001）。PDX肿瘤组织单细胞悬液检测脂质和甘油三酯含量的结果显示,与Antagomir-Control组相比,antagomir-EBV-miR-BART18-3p注射组的S2850/S2928比率和甘油三酯含量均显著降低。以上结果表明,抑制结直肠癌肿瘤中EBV-miR-BART18-3p的表达可以显著减缓肿瘤的生长,延长小鼠生存时间,抑制LDHA、FASN的表达,抑制肿瘤脂肪新生,降低肿瘤的恶性程度。4.2 EB病毒感染及血清EBV-miR-BART18-3p表达水平与结直肠癌发病风险研究Matched Case-Control Power Analysis结果显示健康对照人群和结直肠癌患者例数各为254及以上时可以确保可信度。通过EB病毒ELISA检测试剂盒检测结直肠癌患者和对照人群血清,发现在健康对照人群和结直肠癌患者中EB病毒的感染率均较高,处于95%以上,且无统计学差异（健康对照EB病毒感染率为97.64%,结直肠癌患者为96.46%）,而结直肠癌患者血清中EB病毒滴度远高于健康对照人群,且差异有统计学意义（P＜0.001）,表明高滴度的EB病毒感染是结直肠癌潜在的危险因素之一。结直肠癌患者血清RNA样本的RT-qPCR结果发现,结直肠癌患者血清中的EBV-miR-BART18-3p的表达水平显著高于健康对照人群（P＜0.001）,通过受试者工作特征曲线（ROC）计算曲线下面积（AUC）为0.7317（P＜0.0001）。进一步分层分析发现,在结直肠癌T、N、M各个阶段,结直肠癌患者血清中EBV-miR-BART18-3p的表达水平均显著高于健康对照的表达水平（P＜0.001）。而TNM各阶段AUC分别为0.7519、0.7162、0.7289,且差异有统计学意义（P＜0.001）,提示血清中EBV-miR-BART18-3p对结直肠癌的辅助诊断具有一定的潜在意义。研究结论:1.与结直肠癌癌旁正常组织相比,结直肠癌组织中EBV-miR-BART18-3p的表达水平显著升高,且其表达水平与结直肠癌的发展正相关。2.肿瘤缺氧微环境可以显著升高EBV-miR-BART18-3p的表达水平,并且高表达的EBV-miR-BART18-3p可以增强结直肠癌细胞迁移、侵袭、肿瘤形成等恶性表型。3.结直肠癌细胞中高表达的EBV-miR-BART18-3p通过调控SIRT1/HIF-1α/LDHA通路,促进乙酰辅酶A的生成;乙酰辅酶A的增多促进FASN的表达,增强了结直肠癌组织的脂肪新生作用,促进结直肠癌的发展。4.高滴度的EB病毒感染是结直肠癌潜在的危险因素之一,且血清中EBV-miR-BART18-3p的表达水平对结直肠癌患者的辅助诊断具有一定的潜在意义。