目的:应激,又称应激反应,是机体在受到各种内外环境、社会因素、心理因素刺激时出现的全身非特异适应反应。应激原初作用于机体,导致机体自稳态受到扰乱,出现一系列的生理和行为的适应性反应。而当应激原持续作用于机体时,全身适应性反应表现为一个动态的过程,容易导致疾病的发生。目前研究表明,应激导致的全身性反应主要与以下几方面有关:1.引起广泛的神经内分泌激素变化,例如:ADH,促性腺激素释放激素、胰高血糖素、胰岛素、甲状腺素等;2.下丘脑-垂体-肾上腺皮质激素系统,例如:促肾上腺皮质激素释放激素、糖皮质激素、肾上腺皮质激素、胰高血糖素等;3.蓝斑-去甲肾上腺素能神经元-肾上腺髓质系统,例如:儿茶酚胺、血浆肾上腺素、去甲肾上腺素等。长期慢性应激容易造成动物焦虑、抑郁、恐惧等行为学表现,同时伴随的还有动物体内相应的内分泌-激素变化。焦虑在古代中医典籍中并无明确记载,但是从病因病机、症状表现来看,与中医学的“惊悸”、“怔忡”较为相似,与“不寐”、“奔豚”、“灯笼病”也都有相关性。临床上,焦虑症主要表现为以下四个方面:身体紧张,患者面部肌肉紧张,表情焦灼,难以放松,常常唉声叹气;自主神经反应过高,出现出汗、心悸、呼吸急促、手脚冰凉、大小便过频、喉头阻塞感等症状;过分机警,时时处于警惕状态,小心翼翼;过分担心,为未来担心,包括健康、财产等。病位多责之于心、肝、脾、肾,临床辨证常见证候主要有:阴虚内热、肝郁气滞、痰湿困脾、心脾两虚、肝阳上亢等等,诸多证候中,尤以肝郁气滞、肝郁脾虚、肝郁血虚证最为常见,这一点可以从用药频率中得以佐证。逍遥散作为治疗情志心理疾病的常用方,一直在临床上广泛使用,其疏肝解郁,健脾和营的功效正与临床病机相应,临床使用原方或加减变化,均有良好疗效,为多数医家认可。前期,课题组一直在研究21天慢性束缚应激肝郁脾虚证大鼠模型,以及逍遥散对该模型的干预作用及相关作用机制,提出了很多新的观点和发现。21天慢性不可预知温和应激模型、21天慢性不可预知应激模型与21天慢性束缚应激模型在方法学上大同小异,目前是抑郁症或肝郁脾虚证抑郁症的主要造模方法,已经得到公认。然而,关于大鼠焦虑模型的建立,多年来一直是众说纷纭,莫衷一是,尚无一个公认的标准。近年来,课题组经过比较慢性束缚应激大鼠7天、14天以及21天行为学表现、分子生物学研究结果,发现14天慢性束缚应激可以建立肝郁脾虚证焦虑大鼠模型。为了进一步验证该模型,本次实验将在前期研究的基础上,采用14天慢性束缚应激方法建立肝郁脾虚证大鼠焦虑模型,通过多种行为学方法观察、检测动物模型。同时将肝郁脾虚证的对证治疗药物-逍遥散作为观察药物,选取经典的抗焦虑抑郁药物盐酸氟西汀作为阳性对照药物,通过大鼠行为学及相关分子生物学指标观察逍遥散的抗焦虑作用。为进一步明确逍遥散抗焦虑的作用机理,笔者结合以往文献报道,将JNK/MAPK通路作为研究对象,使用JNK/MAPK通路特异性阻滞剂SP60015作为阳性对照药。为了排除手术、麻醉等因素对实验结果的影响,同时设立手术对照组,5组大鼠进行行为学观察,对逍遥散和SP600125的抗焦虑作用进行对比,并选取JNK/MAPK通路上的相关指标JNK、P-JNK、c-Jun进行研究,明确逍遥散对肝郁脾虚证焦虑模型大鼠的作用机理。方法:(1)将雄性SD大鼠36只随机分为4组:正常组、模型组、氟西汀组、逍遥散组。适应性喂养1周,除正常组外,模型组、氟西汀组、逍遥散组大鼠进行束缚,连续14天,每天3小时。正常组、模型组大鼠给予等量的去离子水灌胃,逍遥散组大鼠给予逍遥散干粉0.61gA00g大鼠/天,溶于去离子水灌胃;盐酸氟西汀组大鼠给予氟西汀0.2mg/100g大鼠/天,溶于去离子水灌胃。分别于0天、7天、15天,观察大鼠一般状态及体重变化;造模第15天,观察4组大鼠旷场实验、糖水消耗实验、高架十字迷宫实验等等各项行为学指标,评价大鼠14天慢性束缚应激肝郁脾虚证焦虑模型造模是否成功,以及逍遥散、盐酸氟西汀对肝郁脾虚证焦虑模型大鼠行为学的干预情况。(2)4组大鼠取材脑海马,通过Western bolt和qRT-PCR方法检测各组大鼠脑海马内P-JNK、JNK、P-c-Jun的表达,观察逍遥散抗焦虑作用与JNK通路的关系。(3)将40只雄性SD大鼠随机分为5组,每组8只,分别为正常组、模型组、SP600125组、手术对照组、逍遥散组。适应性喂养1周,手术对照组和SP600125组大鼠给予头颅双侧脑室置管手术,术后休息1周,以14天慢性束缚方法建立肝郁脾虚证焦虑大鼠模型,5组大鼠除正常组外,其余4组大鼠每日束缚3小时,连续14天。正常组、模型组、手术对照组、SP600125组均给予等剂量的去离子水灌胃,每日1次;逍遥散组给予逍遥散灌胃,逍遥散干粉0.61g/100g大鼠/d,溶于去离子水;手术对照组给予1%DMS0柠檬酸缓冲液双侧脑室注射,2μl/ventricle/d;SP600125 组给予 SP600125 双侧脑室注射，将SP600125 溶于 1%DMSO柠檬酸缓冲液中注射,10ug/2μ1/ventricle/d。造模14天后,观察5组大鼠一般状态、体重变化、高架十字迷宫、新环境进食抑制实验结果。通过逍遥散组与模型组、正常组对比,评价逍遥散对模型动物的调节作用;通过SP600125组与正常组、模型组、手术对照组对比,评价SP600125对模型大鼠一般状态、体重及行为学的影响;通过手术对照组与模型组、正常组的比较,排除手术因素对动物造模的干扰。(4)5组大鼠取材脑海马,通过Elisa方法检测p-JNK、p-c-Jun的表达,Western blot方法检测大鼠海马P-JNK、JNK、P-c-Jun 和 Cyt-C 蛋白表达,qRT-PCR 方法检测 JNK、c-Jun、Cyt-C 基因的表达,评价逍遥散作用于SD雄性大鼠慢性应激焦虑模型的作用机制,与JNK/MAPK通路的关系。结果:(1)实验一,从大鼠的一般状态可以看出,造模14天,正常组及用药组大鼠精神状态良好,毛发光泽明亮,较为整洁,活泼好动,不易激惹,反抗、对峙较弱,对束缚撕咬、挣脱次数较少,大便干稀适中,呈球状;模型组大鼠精神萎靡,毛发凌乱,色泽晦暗,喜蜷伏角落,耳尖明显向背部方向靠拢,烦躁,易激惹,对束缚反应剧烈,反抗、撕咬束缚带,嘶叫,极力挣脱,大便稀溏。体重变化,造模前1天及造模后第7天,4组大鼠体重未见明显差异;到第1 5天,与模型组相比,其余3组大鼠平均体重高于模型组,有统计学差异(P<0.05)。与正常组相比,逍遥散组及氟西汀组大鼠体重无显著性差异。糖水消耗实验,4组大鼠比较无统计学差异。旷场实验,4组大鼠运动总距离、中央区进入次数及停留时间均无统计学差异。高架十字迷宫实验,模型组大鼠运动总距离、双侧开放臂进入次数、双侧开放臂停留时间、中央区进入次数明显低于正常组,具有统计学意义(P<0.05,P<0.01);而双侧封闭臂进入次数、双侧封闭臂停留时间、中央区运动距离比较无统计学差异;逍遥散组、氟西汀组与正常组比较无统计学差异。新环境进食抑制实验,模型组大鼠进食抑制时间明显长于正常组大鼠,有统计学差异(p<0.05);而逍遥散组、氟西汀组大鼠与正常组比较无统计学差异。(2)实验二,Western blot方法检测4组大鼠海马P-JNK、JNK、P-c-Jun表达,模型组各项指标均高于正常组,有统计学差异(P<0.05,P<0.01),逍遥散、氟西汀组与正常组比较,无统计学差异。qRT-PCR方法检测大鼠海马JNK、c-Jun表达,模型组均高于正常组,有统计学差异(P<0.05,P<0.01),逍遥散、氟西汀组与正常组比较,无统计学差异。(3)实验三,40只健康雄性SD大鼠,随机分为5组,正常组、模型组、SP600125组、手术对照组、逍遥散组,每组8只。除正常组外,其余4组大鼠造模14天,模型组及手术对照组大鼠毛发凌乱、色泽晦暗,精神萎靡,容易激惹,行动减慢,耳廓颜色较淡,对束缚反抗剧烈,撕咬挣扎,大便多干稀不调;正常组及用药组大鼠毛发较为整洁,色泽光亮,叫声柔和,动作灵活,耳廓颜色淡红,对束缚挣扎、放抗,但挣脱次数较少,大便呈球状。5组大鼠体重在造模第0天、第7天比较无统计学差异,但在第15天,模型组、手术对照组大鼠体重明显低于正常组,有统计学差异(P<0.05,P<0.01),而逍遥散组、SP600125组与正常组相比无差异。高架十字实验结果,模型组、手术对照组大鼠运动总距离、双侧开放臂停留时间、中央区进入次数与正常组比较有统计学差异(P<0.05,P<0.01),而逍遥散组、SP600125组与正常组比较无明显差异。新环境进食抑制实验,模型组、手术对照组大鼠进食抑制时间明显高于正常组,有统计学差异(P<0.05),而逍遥散组、SP600123组与正常组相比无统计学差异。(4)5组大鼠海马组织匀浆分别提取蛋白质、RNA。Elisa法检测P-JNK、P-c-Jun的表达,模型组、手术对照组P-JNK、P-c-Jun的表达明显高于正常组(P<0.05,P<0.01),有统计学差异;逍遥散组、SP600125组P-JNK、P-c-Jun表达与正常组相比,无统计学差异。Western blot方法检测各组大鼠海马P-JNK、JNK、P-c-Jun、Cyt-C的表达,模型组、手术对照组P-JNK、JNK、P-c-Jun明显高于正常组,有统计学差异(P<0.05,P<0.01);而逍遥散组、SP600125组与正常组相比无统计学差异。5组Cyt-C的表达无统计学差异。qRT-PCR检测各组大鼠海马JNK、c-Jun、Cyt-C的表达,模型组、手术对照组JNK、c-Jun基因的表达明显高于正常组(P<0.01),而逍遥散组、SP600125组与正常组相比无统计学差异。Cyt-C基因的表达在5组间无统计学差异。结论:逍遥散作为治疗情志疾病的经典方剂,对于焦虑、抑郁症具有较好疗效。在本研究中,(1)笔者采用14天慢性束缚应激方法建立肝郁脾虚证焦虑大鼠模型,并通过多种行为学加以评价,包括:大鼠一般状态、体重变化及高架十字迷宫、新环境进食抑制实验。结果表明,14天慢性束缚应激建立肝郁脾虚证焦虑大鼠模型方法较为可靠,能较为准确反应肝郁脾虚证焦虑;阳性对照药物选择经典的抗焦虑抑郁药物-盐酸氟西汀,比较逍遥散的抗焦虑疗效。经过对比,逍遥散具有良好的抗肝郁脾虚证大鼠焦虑作用。(2)逍遥散作用于肝郁脾虚证焦虑模型大鼠的机制尚不清楚,是否与JNK/MAPK通路有关还有待证实。笔者通过检测JNK通路上相关指标,结果发现,逍遥散对模型动物JNK通路上JNK、c-Jun具有调节作用,初步表明逍遥散发挥作用的机制可能与JNK/MAPK通路有关。(3)为进一步明确逍遥散的作用机制与JNK/MAPK通路的关系,笔者引入JNK通路阻滞剂SP600125作为对照药进行比较。综合5组大鼠一般状态、体重、高架十字迷宫、新环境进食抑制实验结果,发现逍遥散和SP600125都具有调节肝郁脾虚证模型大鼠焦虑样行为的作用。(4)采用Elisa、Western blot、qRT-PCR方法从分子生物学角度进一步探讨逍遥散作用于焦虑模型大鼠的机制,结果表明,逍遥散作用于肝郁脾虚证焦虑模型大鼠是通过JNK/MAPK通路发挥作用。但是5组大鼠海马细胞色素C的表达无差异,逍遥散通过JNK通路发挥作用的机制与细胞色素C无关。