【摘 要】
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重金属镉被认为是一种对生物体毒性危害严重的非必需元素,其在机体内的蓄积会对骨骼、泌尿系统、生殖系统、心血管系统以及免疫系统造成损伤,影响生物体生存。一旦发生水体镉污染现象就会导致鱼类的免疫、内分泌、代谢活动异常,主要表现为运动障碍、甚至死亡。Micro RNA(miRNA)是一种非编码的单链小分子RNA,具有转录后调节基因m RNA表达的功能。miRNA涉及许多生物学过程,并在细胞增殖、分化、发育
【基金项目】
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中国自然科学基金(31872531); 黑龙江省自然优青课题(YQ2021C021);
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重金属镉被认为是一种对生物体毒性危害严重的非必需元素,其在机体内的蓄积会对骨骼、泌尿系统、生殖系统、心血管系统以及免疫系统造成损伤,影响生物体生存。一旦发生水体镉污染现象就会导致鱼类的免疫、内分泌、代谢活动异常,主要表现为运动障碍、甚至死亡。Micro RNA(miRNA)是一种非编码的单链小分子RNA,具有转录后调节基因m RNA表达的功能。miRNA涉及许多生物学过程,并在细胞增殖、分化、发育、自噬过程中扮演着重要的角色。自噬是细胞用来防止有毒物质积累的生理过程。它通过将自噬小体与溶酶体融合来降解错误折叠的蛋白质和受损的细胞器。前期全转录组学结果表明,miR-451在富集细胞自噬相关通路的镉中毒致鲤鱼头肾淋巴细胞损伤过程中有重要作用。Target Scan网站预测miR-451的靶基因为cacna1ab。miR-451参与多种生理和病理过程,然而在镉致鲤鱼头肾淋巴细胞自噬的过程中miR-451的具体机制仍未知。通过q RT-PCR(实时荧光定量PCR),Western Blot(蛋白质免疫印迹)和双荧光素酶报告基因系统检测方法来验证cacna1ab是否为miR-451的靶基因。为了探究镉对鲤鱼头肾淋巴细胞的影响,本试验在建立镉暴露鲤鱼头肾淋巴细胞模型基础上,又分别构建了miR-451敲低/过表达以及miR-451、cacna1ab共敲低细胞模型。通过免疫荧光染色、细胞钙离子染色和MDC染色(细胞自噬染色)来分析鲤鱼头肾淋巴细胞损伤情况,利用q RT-PCR,Western Blot方法来检测自噬经典通路相关基因表达的变化,旨在阐明鲤鱼头肾淋巴细胞在镉暴露过程中miR-451通过靶向cacna1ab引起细胞自噬的机制。具体的试验结果如下:1.在镉暴露鲤鱼头肾淋巴细胞模型中,miR-451的m RNA表达水平降低和cacna1ab的m RNA表达水平升高(p<0.05)。钙离子染色结果显示,镉组的淋巴细胞钙离子超载。免疫荧光染色和MDC染色结果都显示镉组淋巴细胞自噬的发生。同时,q RT-PCR结果表明ATG5、LC3-II和Beclin 1的表达升高,m TOR、p62和Bcl-2的表达降低(p<0.05);Western Blot结果表明LC3-I、LC3-II和Beclin 1的表达升高,p62和Bcl-2的表达降低(p<0.05)。2.Targetscan生物信息学软件预测了miR-451的靶基因为cacna1ab,并且双荧光素酶报告基因系统也验证了cacna1ab是miR-451的靶基因。q RT-PCR结果表明miR-451过表达组、cacna1ab敲低组中cacna1ab的m RNA水平降低(p<0.05),而miR-451敲低组中则明显升高(p<0.05),再次证明了miR-451与cacna1ab之间的靶向关系。3.在miR-451敲低/过表达细胞模型中,与对照组和miR-451过表达组相比,钙离子染色结果显示,miR-451敲低组的淋巴细胞钙离子超载(p<0.05);免疫荧光染色和MDC染色结果都显示miR-451敲低组淋巴细胞自噬的发生;同时,q RT-PCR结果表明miR-451敲低组ATG5、LC3-II和Beclin 1的表达升高,m TOR、p62和Bcl-2的表达降低(p<0.05);Western Blot结果表明miR-451敲低组LC3-I、LC3-II和Beclin 1的表达升高,p62和Bcl-2的表达降低(p<0.05)。4.在miR-451与cacna1ab共敲低细胞模型中,cacna1ab敲低能够减少miR-451敲低诱导的钙超载和自噬活化作用。结果表明,镉暴露通过miR-451靶向cacna1ab调控鲤鱼头肾淋巴细胞自噬。综上所述,镉暴露破坏鲤鱼头肾淋巴细胞钙稳态并通过miR-451/cacna1ab轴调控淋巴细胞自噬。本试验首次揭示了与钙稳态相关的miRNA介导镉暴露鲤鱼头肾淋巴细胞自噬的机制,丰富了鱼类体内镉的免疫毒理学机制研究,为生物体的免疫调节机制提供新的理论依据。
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