卵巢癌是最致命的妇科肿瘤，山于缺乏有效的早期诊断及治疗手段，其死亡率一直居妇科肿瘤之首。近年来随着分子生物学技术的不断发展，从分子水平上研究肿瘤发生的机制及其与癌基因、抑癌基因的关系已成为肿瘤基因治疗的主要方向之一，其中卵巢癌也是研究热点之一。1994年Mok等人在研究人正常卵巢上皮细胞与卵巢癌细胞的基因差异表达时，发现一个在正常卵巢上皮细胞中均有表达，而在卵巢癌细胞系及组织中无表达的基因，故将其命名为DOC-2(Differentially expressed in ovarian cancer 2)。人类DOC-2位于染色体5p13，长约35kb，含有15个外显子和14个内含子。cDNA共3268bp，编码长度为770个氨基酸的蛋白质，分子量约为82.5KDa。在其氨基端含有磷酸酪氨酸作用结构域(phosphotyrosine interactingdomain，PID／PTB domain)，羧基端含有多个富含脯氨酸的SH3结合区。DOC-2是具有信号转导功能的新的磷蛋白。它广泛存在于正常组织中，但在许多肿瘤组织和细胞系中低表达或无表达。进一步研究表明它能抑制多种肿瘤细胞系的生长，包括卵巢癌，绒癌，前列腺癌，乳腺癌等，所以DOC-2被认为是一种肿瘤抑制基因，但其究竟是如何发挥功能的，尚不完全清楚。DOC-2／DAB2的主要结构提示DOC-2／DAB2是一种可能的信号分子，通过蛋白质 第四军医大学博士学位论文5一蛋白质相互作用和蛋白磷酸化两种机制发挥作用。 本研究采用RT－PCR的方法从正常人卵巢组织中克隆得到DOC－2氨基端磷酸酪氨酸作用结构域（PID）的 CDNA，经测序证实正确后，将该段序列克隆入原核表达载体pGEX＊T1中，诱导表达得到分子量约为50KD的GST－nDOCZ融合蛋白。利用该表达产物免疫兔，获得了抗DOC一二的多克隆抗血清，为下一步研究DOC－2的功能奠定了基础。 为研究DOC－2对卵巢癌细胞的作用，我们构建了DOC－2 的真核表达载体pCDNA3二一p93 和pIMSZ－EGFPp93，利用脂 质体介导的基因导入法将pCDNA3．1卞93和 pIRESZIGFPp93导入人源性卵巢癌细胞株HO｛ 中，经筛选得到稳定表达昨3蛋白的细胞系8910巾3和8引0EG即中3：利用免疫细胞化学和荧光显微镜观察细胞转染后P93蛋白的表达情况。通过细胞生长曲线，比较卵巢癌细胞系HO－8910与8910－p93、8910一pCDNA3．1（转染空载体ncDNA3．l）的增殖情况；通过软琼脂克隆形成试验比较这3种细胞的克隆形成能力和增殖能力；利用流式细胞仪检测这3种细胞的细胞周期的改变情况：利用透射电镜观察转染p93基因的细胞的超微结构变化；利用裸鼠移植瘤实验比较HO七 与8910个93在动物体内生长状况。结果发现8910P93细胞在细胞增殖、克隆形成率方面均明显低于8910－PCDNA3．1和HO－8910细胞，而后两者之间无明显差异。细胞周期分析 8910p93细胞S期细胞比例降低，GI期细胞比例升高。电镜观察显示转染DOC－2基因的细胞超微结构出现生长抑制特征。HO－8910细胞经P93转染后，在裸鼠体内生长缓慢，肿瘤体积及重量均明显小于对照组。通过以上实验初步证实DOC一二可抑制人卵巢癌细胞 HO－89 0的增殖，对其生长起负调控作用，为今后临床应用DOC－2开展基因治疗提供了实验依据。 为进一步研究DOC－2发挥功能的信号传导通路，寻找与DOC－2基因及其PID结构域相互作用的分子或新的配体，我们应用酵母双杂交技术筛选了胎脑CDNA文库，将构建于DNA－BD的Bait载体克隆入酵母菌株AH刁09中。通过表型自激 Dopartment OfGynaecoIOgy and Obstetrl。，幼M旧 HpmL FI，ruHt＊t 第四军医大学博上学位论文Z活检测以及p一半乳糖苦酶检测排除了诱饵蛋白nDOC大的自激活功能，而发现Die《蛋白有自激活，间接证实DOC大本身就是一个信号传导分子。通过筛选文库，我们得到了 21个与 nDOC－2基因相互作用的候选基因，并对部分进行了测序分析，对这些基因将进行深入分析，为DOC－2基因的进一步研究作了前期的基础性工作。