结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率一直高居不下。尽管诊治方法不断进步,结直肠癌的治疗效果仍不理想。业已公认,结直肠癌的发生、演进是一个多因素参与、多基因改变的多步骤过程,而转移是威胁患者生存的最重要的因素。因此,寻找转移相关基因和有效的预后标记物对于认识结直肠癌的演进机制,实施有效靶向治疗具有重要的理论和实践意义。神经生物学研究显示,轴突导向分子SEMA3F及其受体NRP2具有排斥上颈神经节轴突和调节神经系统发育的功能。近年发现,SEMA3F和NRP2亦表达于肺癌、乳腺癌、卵巢癌以及结直肠癌等人类多种恶性肿瘤组织,提示其在肿瘤生物学行为调节中可能发挥重要作用。已有的研究结果显示,SEMA3F和NRP2虽然是配受体关系,但NRP2亦能够通过其他信号通路介导与SEMA3F截然相反的生物学效应。因此,我们推测SEMA3F和NRP2的比值可能是决定肿瘤演进的关键因素,其分子间的相互作用与临床意义值得探讨。然而,目前针对SEMA3F和NRP2分子的肿瘤大样本临床研究非常缺乏,二者在常见肿瘤结直肠癌中的表达特点及其临床病理学意义尚待探讨,对肿瘤预后的影响亦未见报道,SEMA3F的表达对结直肠癌细胞的作用及其机制还有待进一步阐明。为此,本研究分为两部分:第一部分采用免疫组织化学和免疫印迹技术在大样本临床资料上观测了SEMA3F与NRP2在人结直肠癌中的表达特点,并探讨其临床意义;第二部分通过慢病毒干扰技术沉默结直肠癌细胞SEMA3F基因表达,然后采用基因芯片技术研究了差异基因表达特点,进一步探讨了SEMA3F对结直肠癌细胞生物学功能的影响及其分子机制。主要研究结果和结论如下:1.在结直肠癌发生和演进过程中NRP2表达呈现“双峰”改变NRP2蛋白定位于结直肠癌及正常结肠黏膜上皮细胞胞浆,其表达在正常粘膜、癌旁增生性粘膜(包括腺瘤在内的轻、中、重度不典型增生粘膜)以及肿瘤组织中依次增强,以癌旁粘膜表达阳性率最高;肿瘤组织中NRP2在结直肠癌早期表达下调,低于癌旁组织,晚期则显著上调,与癌旁组织水平相近甚至高于之;NRP2表达与结直肠癌的浸润深度、Dukes分期、淋巴结转移、TNM分期、远处转移、复发等临床病理特征显著正相关,与分化程度负相关,在淋巴结转移灶中的表达显著强于原发灶。以上结果提示,NRP2的上调表达可能在结直肠黏膜癌变的早期就已出现,可能与肿瘤的发生、分化、侵袭和转移有关。2. SEMA3F在结直肠癌粘膜癌变过程中表达上调,随着肿瘤演进表达下调SEMA3F蛋白定位于结直肠癌细胞及正常结肠黏膜上皮细胞胞浆,其表达在正常粘膜、癌旁增生性粘膜(包括腺瘤在内的轻、中、重度不典型增生粘膜)中依次增强,在重度不典型增生粘膜中到达“平台期”,然后在肿瘤组织中下调,显著低于癌旁组织;随着Dukes分期增高,癌组织以及癌旁组织的SEMA3F表达均显著降低;SEMA3F表达与结直肠癌的淋巴结转移、Dukes分期、肿瘤复发显著负相关,在淋巴结转移灶中SEMA3F表达显著弱于原发灶。以上结果提示,SEMA3F表达上调可能是结直肠癌发生的早期事件,表达下调与结直肠癌的演进密切相关,并可能促进肿瘤的淋巴结转移和复发。3.SEMA3F、NRP2表达水平与结直肠癌的淋巴管生成相关结直肠癌组织的微淋巴管的分布、形态和数量存在异质性;结直肠癌组织及癌旁粘膜的微淋巴管密度与淋巴结转移和NRP2表达正相关,与SEMA3F表达显著负相关。以上结果提示,SEMA3F可能对淋巴管生成具有抑制作用,而NRP2则与之相反。4.SEMA3F、NRP2表达水平影响结直肠癌患者预后NRP2表达与患者预后显著负相关;肿瘤具有高T/A比值(癌组织NRP2表达与癌旁组织NRP2表达的比值,≥2)的患者预后显著差于肿瘤有低T/A比值(<2)的患者;SEMA3F表达与患者预后显著正相关;当肿瘤NRP2表达强于SEMA3F时患者预后最差,而NRP2表达弱于或等于SEMA3F者预后最好,NRP2和SEMA3F双阴性患者预后介于二者之间;肿瘤的转移、复发以及SEMA3F表达、NRP2和SEMA3F表达比值是独立的预后因素。5.下调SEMA3F表达调控多基因表达采用siRNA干扰结直肠癌细胞SEMA3F表达共筛选出709条表达上调的差异表达基因和759条表达下调的差异表达基因;经GO分类比对,共有1468条基因与63个GO分类匹配,涉及生物过程的相关性较高的GO以对细胞生长与增殖、细胞运动、细胞肌动蛋白丝重组、组织器官发育、细胞过程的调节的影响最为显著,细胞组份以细胞前缘最为突出,提示SEMA3F基因广泛参与了细胞的多项生命过程并对之有显著影响。6.SEMA3F的功能可能涉及多个信号分子改变KEGG通路分析显示:多条肿瘤信号通路、增殖相关的细胞周期信号通路,以及与细胞运动迁移密切相关的肌动蛋白骨架通路发生显著改变,提示调节细胞增殖、迁移、转移相关的信号通路改变可能是SEMA3F基因参与肿瘤发生、发展的重要分子机制。结论:1.SEMA3F与NRP2的上调可能是结直肠癌发生的早期事件,提示其可能参与了结直肠癌的发生;2. NRP2的上调与结直肠癌的分化、转移、复发以及淋巴管生成等恶性特征正相关,提示其可能作为促转移基因参与了结直肠癌的演进;3. SEMA3F表达与结直肠癌的转移、复发以及淋巴管生成负相关,调节细胞增殖、迁移、转移相关的信号通路改变可能是其参与肿瘤发生、发展的重要分子机制,提示SEMA3F可能作为肿瘤抑制基因阻遏结直肠癌的发生与演进;4.NRP2和SEMA3F表达和二者的比值,以及肿瘤与癌旁组织的NRP2表达比值与结直肠癌患者预后密切相关,可能是预测结直肠癌预后的重要指标。