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本研究从发病黄颡鱼体内分离出一株病原菌,命名为GD1609211。通过生理生化特征、染色镜检以及16S rRNA基因序列分析等方法,确定GD1609211为迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda E.tarda)。通过构建E.tarda-EvpC原核表达质粒并诱导表达,并制备该蛋白的多克隆抗体,从而对表达蛋白抗体介导的免疫荧光检测人工感染E.tarda后EvpC基因在黄颡鱼体内的表达时相与蛋白定位分析,以探讨EvpC基因功能,为深入了解T6SS致病机理提供重要理论依据。主要结果如下:1.采集患病黄颡鱼病料,其主要症状为下颌出血,肛门红肿,头部皮肤破溃以及肝脏出血肿胀。从发病黄颡鱼的肝脏以及肾脏内分离纯化得到一株病原菌,命名为G D1609211。表型、生理生化以及16S rRNA引物测序等方法鉴定,结果显示:GD1609211镜检为革兰氏阴性短杆状菌,在营养琼脂上形成灰白色圆形凸起、表面光滑的菌落。16S rRNA基因序列与迟缓爱德华氏菌的同源性为99%,构建系统发育分析显示与迟缓爱德华氏菌聚为一支,该病原菌具有产酸产气、产吲哚、产硫化氢,能够在半固体琼脂生长等迟缓爱德华氏菌特有的生理生化特性。人工感染实验结果表明:GD1609211是本次课题研究内黄颡鱼发病的主要致病菌,其半数致死量为1.23?10~5 CFU/m L,属于高致病性菌株。药敏试验结果显示:GD1609211对诺氟沙星、头孢唑林、头孢氨苄和头孢哌酮等12种抗生素敏感,对麦迪霉素、卡那霉素和丁胺卡那等6种抗生素中度敏感,对复方新诺明、庆大霉素、红霉素和头孢拉定等10种抗生素不敏感。2.根据GenBank(登录号:AY424360)上发表的迟缓爱德华氏菌EvpC基因ORF两端的保守区设计一对引物,用无缝克隆PCR方法从GD1609211株黄颡鱼源爱德华氏菌毒力质粒上扩增出EvpC片段并成功克隆至pET-28b表达载体后进行测序。将测得的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列与GenBank(登录号:AY424360)公布的序列进行同源性比较,结果表明核苷酸长度为492 bp,同源性为99%,氨基酸同源性为99%。3.将经Nco I和Xho I两种限制性内切酶双酶切后重组质粒pET28b-EvpC转化至宿主菌BL21(DE3)感受态细胞中,利用IPTG作为诱导剂进行诱导表达,获得了分子量大小约为17.86 kDa的pET-28b-EvpC重组蛋白,与预期表达蛋白分子量大小相符;将该重组蛋白纯化后对家兔进行三次免疫,得到了兔抗pET-28b/EvpC重组蛋白的高免血清;并采用迟缓爱德华氏菌人工感染黄颡鱼,攻毒后于不同时间采集脾脏、肝脏、肾脏、肠道、脑等组织,经建立的EvpC基因表达蛋白抗体介导的间接免疫荧光方法,检测E vpC基因在黄颡鱼体内的表达时相、并对该基因表达蛋白侵染与定位分布进行分析。结果显示:黄颡鱼感染迟缓爱德华氏菌强菌株后,EvpC基因即可在脾脏、肝脏、肠道、脑、鳃中编码蛋白,4 h时,在肾脏、肝脏、脾脏中表达蛋白荧光反应。12 h时,能够在肠道组织中检测到编码蛋白阳性信号,24 h后,脑组织中检测到蛋白荧光阳性反应。研究表明:肝脏、脾脏、肾脏和脑组织是EvpC基因编码蛋白主要的靶器官或靶组织,且在靶组织中的侵染与分布有一定的选择性。