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Rap1属于小分子GTP结合蛋白超家族成员之一。它与细胞生长、分化和生存有密切关系。Rap1除具有逆转原癌基因Ras激活突变体所导致的细胞形态改变而被认为是Ras的拮抗物外，最近的研究还发现Rap1在一系列的细胞系统中有独立于Ras之外的功能，如控制与细胞粘附有关的事件等，因而成为研究的热点。 Rap1，和Ras一样，具有GDP结合的无活性形式和GTP结合的活性形式。这两种结构的转换是受特异的鸟苷酸转换因子（guanine nucleotide exchange factors（GEFs））所激活和受GTP酶激活蛋白(GTPase activating proteins（GAPs）)失活相应调控的。 目前对Rap GEFs的研究比较多，相比之下有关Rap1GAP以及其作用机制方面的研究较少。其实Rap1的失活和其激活一样重要。只有当Rap1GTP在其GAP的作用下被水解为无活性的GDP结合形式时，它才能够在GEF的作用下被重新激活，从而保证细胞根据外界环境的变化做出及时的反应。 由于Rap1GAP和RasGAP及其它小分子G蛋白的GAP（如RanGAP、RhoGAP）相比在序列上没有同源性，并且Rap是唯一一个在switch Ⅱ上没有保守谷氨酰胺的小分子G蛋白。而这个谷氨酰胺是GAP分子上具有催化功能的精氨酸指（arginin finger）作用的位点。因此Rap1GAP催化Rap1GTP分子中GTP水解的机制与其它小分子G蛋白的GAP不同。 最近研究发现，某些Gα亚单位可与Rap1GAP结合而调节Rap1GAP的活性或影响异源三聚体G蛋白的信号转导。表明Rap1GAP在细胞信号转导中所起的作用远比仅仅是一个GAP更复杂。它可能除具有GAP作用外还参与细胞信号网络的交叉调控。 为了研究Rap1GAP的作用机制及Rap1GAP在信号转导中的作用，我们应用酵母双杂交体系（yeast two hybrid system）寻找潜在的与Rap1GAP相作用的蛋白质。由于对C.elegans的研究较详细，对其每个基因的功能及DNA序列已经清楚，故我们首先应用 C ons来源的 RcyGAP作为饵蛋白探查 C elegQns的 cDNA文库。如果发现编码与RapGAP相互作用的蛋白质的基因与人具有同源性，则进一步研究人的相关基因。 在酵母双杂交系统中，将pPC97－RpG”与pPC86七DNA文库共转化入酵母菌Y190细胞，经过一LTH筛选后，有63个菌落拟为阳性菌落。进一步做Lac Z鉴定，19个菌落为阳性，其中 7个菌落为强阳性。将酵母菌中提取的质粒经 PCR扩增，有 12个菌落出现阳性结果。将 PCR扩增阳性及／或 Lac Z强阳性质粒电转化入 DHS a细菌，提取质粒后酶切、测序。发现有 6个来源于 C elegQns cDNA文库的DNA片段编码的蛋白可以与Ra帅AP相互作用，其中两个为RaPGAP。将这两个基因片段重新与 pPC97RapGAP共转化入Y190 酵母菌，再次经一LTH和 Lac Z筛选，并以不同对照组做参照以排除假阳性可能性，结果证明两个分子C elopns来源的Ra灿AP蛋白在酵母双杂交系统中确实可以相互作用。 是否人＊ l GAP在哺乳动物细胞中也能形成二聚体呢？为解决这个问题，我们构建T pCDNA3llMYC－Rp1GAP和pMTZ－HA－RaplGAP重组质粒，将其共转染入 AI4细胞。通过 CO－IP的方法，证实人 Rap GAP在 AI4细胞中也以二聚体的形式存在。 那么＊ l GAP蛋白分子中哪部分（或哪个结构域）与二聚体的形成有关呢？根据 R叩 GAP蛋白的分子结构，我们分别删除了 Rap GAP分子中的 golOCO结构域（AG），N一末端 75个氨基酸（N），C一末端243个氨基酸（AC）和同时删除N一末端、C一末端氨基酸的NC。将编码上述删除体的质粒分别构建到pMTZ－HA载体中、将以上删除体分别与MYC标记的全长R8plGAP质粒共转染入川 细胞中，同时我们还对R邓 GAP分子中的PKA磷酸化位点突变体（MP）进行了检测。通过 CO－IP方法，发现上述删除体和突变体都能和全长 RplGAP形成二聚体。 由于西 NC为 GAP活性的最小结构单位。有研究表明，在 N末端己删除的基础上，继续删除第 754 位氨基酸，将导致 RplGAP失去全部 GAP活性。而R…GAP的催化结构域位于ZIO上97氨基酸。因此，是否RaplGAP分子中第乃4氨基酸与二聚体的形成有关，以及二聚体形成对其活性是否有影响是我们要解决的问题。由于 RapGAP二聚体的形成是一个相当保守的现象，存在于从 CelegQns到人类的种属中。因此我们推测与二聚体形成有关的氨基酸应该存在于保守氨基酸中。我们对NC片段中75十 位的4个保守氨基酸抢2，90，94，99)逐一进行了点突变，构建了其州一HA《apg由重组质粒，与 pCDNA－MYC·agg叨一全长 RplGAP共转染入 A14细胞中，通过 COJP发现，第 82位保守氨基酸的突变不影响面NC与全长RaplGAP形成二聚体，而其它点突变体则不能继续形成二聚体。 是否二聚体的形成会影响其GAP催化活性呢？为了检测不同突变体的GAP 2活性，首先要得到纯化的蛋白。我们构建了突变体的GST融合蛋白质粒，经转化入表达型 BLZI菌株后，IPTG诱导表达 GST融合蛋白，经 GA beads吸附得到纯化的突变体蛋白。 本文采用a卫中标记的 GTP与纯化的 RaplA共孵育，使RaplA全部与放