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目的:1.探讨麦芽酚铝暴露对大鼠皮质神经元细胞miR-29a、miR-29b1、BACE1和Aβ1-42表达的影响;2.通过建立高表达miR-29a或miR-29b1的细胞模型,进一步探讨miR-29a和miR-29b1在铝致Aβ沉积过程中对BACE1表达的调控机制。3.通过对神经元细胞体外干预实验,探讨NF-κB在铝致miR-29a和miR-29b1异常表达中的作用。方法:1.取新生24 h内的SD大鼠乳鼠的皮质进行原代神经元培养,培养至第三天时加入10μmol/L的阿糖胞苷,应用免疫组化法检测神经元特异性表达蛋白Neuron-specific classⅢβ–Tublin的表达来进行神经元纯度检测。应用不同浓度麦芽酚铝染毒大鼠皮质神经元细胞,剂量分别为空白对照组(0μmol/L)、低剂量组(20μmol/L)、中剂量组(40μmol/L)、高剂量组(80μmol/L)4组,继续培养24 h收集细胞和细胞上液,RT-PCR检测miR-29a、miR-29b1、BACE1 mRNA表达水平,ELISA法检测BACE1蛋白、Aβ1-42含量。2.采用慢病毒感染实验方法将外源性的miR-29a或miR-29b1转入皮质神经元细胞,以建立高表达细胞模型。实验分组分别为:空白对照组、单独染铝组(包括低剂量组(20μmol/L)、中剂量组(40μmol/L)、高剂量组(80μmol/L))、转染阴性组、目的基因转染组,目的基因转染组完成转染后进行麦芽酚铝染毒,分别为转染阳性对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组。继续培养24h后收集各组细胞和细胞上液,RT-PCR检测BACE1 mRNA表达水平,ELISA法检测BACE1蛋白、Aβ1-42含量。3.培养hek293细胞系,并采用脂质体转染技术将外源性的mir29a或mir-29b1转染入细胞,建立高表达细胞模型。实验分组分别为:空白对照组、单独染铝组(包括低剂量组(100μmol/l)、中剂量组(200μmol/l)、高剂量组(400μmol/l))、转染阴性组、目的基因转染组,目的基因转染组完成转染后进行麦芽酚铝染毒,分别为转染阳性组、低剂量组、中剂量组和高剂量组。继续培养24h后收集各组细胞和细胞上液,rt-pcr检测bace1mrna表达水平,elisa法检测bace1蛋白、aβ1-42含量。4.培养大鼠皮质神经元细胞,分别选择nf-κb激动剂(tpa)和抑制剂(pdtc)对细胞进行干预实验,实验分组分别为:空白对照组、nf-κb激动剂组(1μm)、nf-κb抑制剂组(50μm)、麦芽酚铝染毒组(40μm)、麦芽酚铝+nf-κb抑制剂组,继续培养24h后收集各组细胞和细胞上液,rt-pcr检测mir-29a、mir-29b1、bace1mrna表达水平,elisa法检测bace1蛋白、aβ1-42含量。结果:1.培养大鼠皮质神经元细胞并进行免疫组化实验发现,神经元细胞纯度达到95%。应用不同剂量麦芽酚铝染毒原代神经元细胞后,随着染毒浓度的增加,bace1mrna和bace1蛋白表达量明显增加,与对照组相比,中、高剂量组差异有统计学意义(p<0.05);aβ1-42水平明显增加,中、高剂量组差异有统计学意义(p<0.05);mir-29a和mir-29b1表达量不同程度下降,与对照组相比,低剂量组差异无统计学意义(p>0.05),中、高剂量组差异有统计学意义(p<0.05)。2.分别对大鼠皮质神经元细胞转染mir-29a和mir-29b1后发现,与空白对照组相比,转染阴性组bace1mrna、bace1蛋白表达无明显变化(p>0.05),转染阳性组bace1mrna、bace1蛋白表达下降,但bace1mrna下降无统计学意义(p>0.05),bace1蛋白下降有统计学意义(p<0.05);与同等剂量单独染铝组相比,转染后联合麦芽酚铝染毒组bace1mrna、bace1蛋白表达下降,低剂量组下降无统计学意义(p>0.05),中、高剂量组下降有统计学意义(p<0.05)。与空白对照组相比,转染阴性组aβ1-42水平无明显变化(p>0.05),转染阳性组aβ1-42水平降低,差异有统计学意义(p<0.05);与同等剂量单独染铝组相比,转染后联合麦芽酚铝染毒组aβ1-42水平明显降低,低剂量组差异无统计学意义(p>0.05),中、高剂量组差异有统计学意义(p<0.05)。3.采用脂质体转染方法将外源性的mir-29a和mir-29b1分别转染hek293细胞36h后,经rt-pcr检测发现mir-29a和mir-29b1的相对表达量分别达到427和480倍,转染完成后麦芽酚铝染毒24h。其结果显示,与空白对照组相比,单独染铝组bace1mrna、bace1蛋白和aβ1-42表达量明显升高(p<0.05),转染阴性组bace1mrna、bace1蛋白和aβ1-42表达量无明显变化(p>0.05),转染mir-29a各组bace1mrna、bace1蛋白和aβ1-42表达降低,但bace1mrna降低无统计学意义(p>0.05),bace1蛋白和aβ1-42降低有统计学意义(p<0.05);转染mir-29b1各组bace1mrna、bace1蛋白和aβ1-42表达都降低(p<0.05);与同等剂量单独染铝组相比,转染mir-29a或mir-29b1后联合麦芽酚铝染毒组bace1mrna、bace1蛋白和aβ1-42表达量都明显降低,差异有统计学意义(p<0.05)。4.对皮质神经元细胞干预实验后发现,与空白对照组相比,nf-κb激动剂组和单独麦芽酚铝染毒组mir-29a、mir-29b1表达下降(p<0.05);nf-κb抑制剂组mir-29a、mir-29b1表达升高,但mir29a升高有统计学意义(p<0.05),mir-29b1升高无统计学意义(p>0.05);与单独麦芽酚铝染毒组相比,麦芽酚铝染毒联合nf-κb抑制剂组mir-29a、mir-29b1表达升高(p<0.005)。与空白对照组相比,nf-κb激动剂组和单独麦芽酚铝染毒组bace1mrna、bace1蛋白和aβ1-42表达量明显升高(p<0.05);nf-κb抑制剂组bace1mrna、bace1蛋白和aβ1-42表达量降低,但bace1mrna降低无统计学意义(p>0.05),bace1蛋白和aβ1-42降低有统计学意义(p<0.05);与单独麦芽酚铝染毒组相比,麦芽酚铝染毒联合nf-κb抑制剂组bace1mrna、bace1蛋白和aβ1-42表达量降低,差异有统计学意义(p<0.05)。结论:1.麦芽酚铝能导致大鼠皮质神经元mir-29a、mir-29b1表达降低,并使在aβ生成过程中起关键作用的bace1的表达增加,最终引起aβ1-42沉积。2.麦芽酚铝导致大鼠皮质神经元Aβ1-42沉积,其机制可能与mi R-29a、miR-29b1调控BACE1的表达有关。3.NF-κB的激活可能参与了铝致大鼠皮质神经元miR-29a和miR-29b1异常表达的过程。本课题为国家自然科学基金“mi R-29在铝引起脑内Aβ沉积过程中的作用机制研究(编号:81302410)”。