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不明原因发热(Fever of unknoen origin,FUO)是一种常见的临床综合征,以发热为主要临床表现,很多情况下难以辨别发热的病因,国内外有许多文献对不明原因发热的病因进行了统计分析,主要分为:感染性疾病、非感染性疾病、肿瘤性疾病及其他疾病,其中感染性疾病为主要病因,而感染性疾病中又以细菌感染为主,但近年来病毒感染呈现上升的趋势。目前对于病毒的检测,传统的免疫学方法以及分子生物学方法发挥了重要的作用,作为许多病毒核酸检测的金标准,PCR技术有着较高的准确性和灵敏度,但是只能够检测出已知序列的病毒。由于病毒分布广泛,种类繁多,目前人类已知的致病性病毒仅占所有病毒的0.1%,自然界中仍有大量未知的病毒,同时病毒本身还具有高度的变异性,这就使大多数传统方法无法快速准确的检测出病毒。面对许多传统方法难以检测的病毒,人类迫切需要一种简单可靠的方法对其作出准确的鉴定。随着高通量测序技术及生物信息学技术的飞速发展,病毒宏基因组学(viral metagenomics)逐渐成为了人类研究新型病毒的重要手段。病毒宏基因组学利用随机六聚体引物,可以对特定样本中的所有病毒核酸序列进行反转录及扩增,从而能够检测出样本中已知及未知病毒。为了探究不明原因发热患者肺泡灌洗液中病毒群落与不明原因发热之间的关系,本研究利用病毒宏基因组学方法对采集自江苏大学附属人民医院的肺泡灌洗液病毒群落进行分析。本课题主要研究内容与结果如下:(一)肺泡灌洗液病毒群落组成对采集的56份肺泡灌洗液进行分析后,发现肺泡灌洗液中的病毒群落主要包括:指环病毒科(Anelloviridae)19.4%,未分类科病毒(None)25.0%,藻去氧核糖核酸病毒科(Phycodnaviridae)11.2%,环状病毒科(Circoviridae)11.1%,人类内源性逆转录病毒科(Human endogenous retrovirus,HERV)10.3%,冠状病毒科(Coronaviridae)1.2%,帚状病毒科(Virgaviridae)2.4%,逆转录病毒科(Retroviridae)3.2%,杯状病毒科(Caliciviridae)1.8%,疱疹病毒科(Herpesviridae)0.9%,虹彩病毒科(Iridoviridae)1.8%,拟菌病毒科(Mimiviridae)2.4%,小DNA 病毒科(Parvoviridae)2.1%,小 RNA 病毒科(Picornaviridae)0.6%,痘病毒科(Poxviridae)5.0%,囊泡病毒科(Ascoviridae)0.3%,双生病毒科(Geminiviridae)0.3%,杆状病毒科(Baculoviridae)0.6%,非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)0.3%,Sphaerolipoviridae 0.3%,Marseilleviridae 0.3%。从文库中各病毒相关的序列数上看,指环病毒科的序列数最多,共2207条,占总体序列数的45.3%,环状病毒科占1.3%,藻去氧核糖核酸病毒科占1.9%,人类内源性逆转录病毒科占1.4%,痘病毒科占28.1%,帚状病毒科占13.5%,未分类科病毒6.9%(336条),小RNA病毒0.1%(5条)。肺泡灌洗液病毒群落分析提示:①指环病毒科和痘病毒科、环状病毒、藻去氧核糖核酸病毒科、未分类科病毒等共同构成了肺泡灌洗液病毒群落;②指环病毒同时分布于4个文库中,病毒种类占总体病毒群落的19.4%,并且与其相关的序列数明显多于其他病毒;③环状病毒科及藻去氧核糖核酸病毒科病毒占比较多,但相关的序列数较少,相反比例较少的痘病毒科则具有较多序列数;④与帚状病毒科病毒相关的序列数较多,但仅存在于5号文库中;⑤文库中存在多种常见的呼吸道病毒。(二)文库中细环病毒的研究在肺泡灌洗液样本中分离出了 4株细环病毒,该病毒是人体内常见病毒之一,它的感染可能与某些疾病相关,但尚不明确细环病毒的具体致病机制。本研究仅获得了细环病毒的部分序列,其中最长的序列为2918 bp,主要包括ORF1(389-2593 bp)、ORF2(51-515 bp)、ORF3(2070-2540 bp)和 ORF4(2401-2784 bp)。根据该序列设计巢式PCR引物对80份肺泡灌洗液样本进行筛选后发现共有9份阳性样本,阳性率为11.3%,而作为阴性对照的40份咽拭子样本中阳性样本仅2份。根据病毒的ORF1氨基酸序列构建系统发育树,分析后显示这4株细环病毒与来自人类血浆的细环病毒聚集,同源性在89-94%之间。(三)文库中鼻病毒的研究鼻病毒作为呼吸道感染的重要病毒性病原体,可导致哮喘及支气管扩张等严重并发症。本研究通过巢式PCR共筛选出8份阳性样本,阳性率为10.0%,依据鼻病毒相对保守的VP4/VP2区核酸序列构建系统发育树,提示4株属于人鼻病毒A型,3株属于人鼻病毒B型,分别与来自人鼻咽拭子中的鼻病毒聚集,同源性皆在95%以上。(四)主要结论:①肺泡灌洗液样本中的病毒群落呈多态性,其中以指环病毒为主体;②细环病毒与不明原因发热有一定的联系,结合研究结果可以推断发热所造成的炎性环境及免疫功能低下可以促进TTV的增殖;③由于鼻病毒所占比例较少、与其相关的序列数少,其与发热之间的关联需要进一步研究。