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在真核生物中自噬是一种高度保守的分解代谢过程,通过溶酶体与自噬体相融合从而降解多余的细胞成分或有害物质,用以维持细胞生理稳态和响应饥饿或其他恶劣环境。自噬可以分为非选择性和选择性自噬,选择性自噬根据其降解底物的不同又可以分为线粒体自噬、内质网自噬和细胞核自噬等。嗜热四膜虫有性生殖时期亲本大核的程序性死亡（programmed nuclear death,PND）是一种独特的细胞核自噬类型,多种自噬相关蛋白参与调控PND过程。本研究从嗜热四膜虫中鉴定了ATG5自噬相关基因,对ATG5基因在PND过程中的功能进行了分析。主要结果如下:1.自噬相关基因ATG5生物信息学分析:基于人和酿酒酵母Atg5氨基酸序列,在嗜热四膜虫基因组数据库（http://www.ciliate.org）中进行同源序列比对发现基因TTHERM00494030与人和酵母的Atg5蛋白同源,都具有APG5保守结构域。因此,预测TTHERM00494030基因为四膜虫自噬相关基因ATG5。系统发育分析表明,嗜热四膜虫Atg5蛋白与原生动物草履虫中Atg5蛋白的进化地位相近。对嗜热四膜虫自噬相关蛋白Atg5潜在的相互作用蛋白进行预测,发现其可能与核心自噬蛋白包括Atg8与Vps34存在相互作用。而Atg8和Vps34是嗜热四膜虫PND过程中重要的调控因子。之后,对ATG5基因表达图谱进一步分析发现ATG5在生长期、饥饿期和有性生殖时期均有表达,接合10 h时特异性高表达,而这一时间点对应于亲本大核PND阶段。这一结果暗示嗜热四膜虫自噬相关蛋白Atg5可能参与调控亲本大核PND过程。2.ATG5参与调控亲本大核PND过程:为了研究自噬蛋白Atg5在PND过程中的功能,构建了带有HA标签的过表达质粒pXS75-ATG5,利用基因枪转化至嗜热四膜虫中,通过巴龙霉素浓度梯度筛选获得过表达ATG5突变细胞株。亚细胞定位分析显示在有性生殖2 h、4 h和6 h,自噬相关蛋白Atg5均定位于细胞质中;8 h,Atg5开始定位于亲本大核上,直至亲本大核退化消失。经Cd2+诱导ATG5高效表达后,亲本大核核膜与自噬溶酶体的融合以及亲本大核酸化并未受到影响,但延缓了亲本大核整体凝缩降解,表明Atg5可能全程参与调控亲本大核的PND过程。为了进一步揭示Atg5在PND中的调控功能,我们构建了RNAi-ATG5敲减突变细胞株。有性生殖8 h,敲减ATG5引起19.4%的配对细胞中小核减数分裂产物降解受阻;有性生殖10 h,12.7%的配对细胞中亲本大核向细胞底部的迁移受到影响,同时亲本大核无法正常凝缩降解,无法正常酸化;有性生殖36 h,仍有22%的配对分离细胞中存在未降解的亲本大核。这些结果表明Atg5参与调控小核减数分裂产物和亲本大核的程序性降解。3.Atg5通过介导Atg8.2的定位以及脂化调控亲本大核的降解:Atg8是自噬体膜延伸和降解货物识别的关键因子,Atg8的招募和定位依赖于Atg12-Atg5-Atg16复合物。在本研究中,通过免疫共沉淀以及质谱分析,发现Atg5与Atg8.2存在相互作用,因此进一步构建了融合HA标签的过表达质粒pXS75-ATG8.2,间接免疫荧光定位分析,野生型和OE-ATG8.2的配对细胞中,Atg8.2被招募到亲本大核附近并逐渐定位到亲本大核核膜上。RNAi-ATG5突变细胞和OE-ATG8.2突变细胞配对,在亲本大核PND过程中,Atg8.2的招募受到影响,无法定位至亲本大核核膜上。为了进一步研究敲减Atg5对PND过程中Atg8.2功能的影响,通过Western Blot检测HA-Atg8.2和HA-Atg8.2-PE蛋白表达水平。结果表明,敲减Atg5后,Atg8.2的脂化显著受到影响。上述结果表明Atg5通过影响PND过程中Atg8.2的定位和脂化,进而参与调控亲本大核的降解。综上所述,本研究鉴定了嗜热四膜虫自噬相关基因ATG5,亚细胞定位分析Atg5在PND过程中定位于亲本大核,过量表达ATG5延缓了亲本大核整体凝缩降解,敲减ATG5引起细胞中小核减数分裂产物降解受阻,同时亦会阻碍PND过程中亲本大核向细胞底部迁移、酸化以及正常凝缩降解。进一步分析证实Atg5与Atg8.2存在相互作用,ATG5调控Atg8.2的脂化并进一步影响其在亲本大核上的定位。