基于荧光纳米颗粒标记的盐酸克伦特罗荧光免疫层析试纸的研究

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成功制备了CL免疫原和包被原,免疫小鼠后进行了细胞融合,应用杂交瘤技术筛选出了3株敏感特异的杂交瘤细胞,其中1F8细胞株的细胞培养上清的效价达到了1:1280。用1F8细胞株接种用液体石蜡处理过的小鼠,采集腹水,检测腹水的效价为1:512000,间接竞争ELISA结果显示腹水IC50为2.45ng/mL。CL-McAb的亲和常数(Ka)为4.78×1010L/mol,与其他药物的交叉反应率均小于0.08%,获得了高效价、高敏感性、高亲和力和高特异性的CL-McAb。采用反相微乳法制备了SiO2纳米颗粒,通过改变DDW的量得到了粒径在14~97nm之间的分散性较好、粒径均一的球形SiO2纳米颗粒。同时采用St ber法制备了SiO2纳米颗粒,通过改变TEOS的量得到了粒径在93~398nm之间的单分散、粒径均一的球形SiO2纳米颗粒。用硅烷偶联剂APTS对制备的SiO2纳米颗粒进行有水条件下的表面修饰,用傅里叶红外光谱仪检测改性结果,证明改性成功。选择具有优良发光性能的稀土配合物BHHCT-Eu3+为荧光材料,在反相微乳法合成SiO2的基础上,制备了共价型稀土荧光纳米颗粒,通过多次包壳,增加了荧光纳米颗粒的荧光强度。在TEM下,稀土荧光纳米颗粒呈现均匀的球状结构,粒径为59±5nm,具有较好的分散性。利用氧化后Dextran-500k的醛基成功的将带氨基的稀土荧光纳米颗粒和CL-McAb联接,将稀土荧光抗体喷涂在结合垫上,分别选择CL-BSA和SPA作为NC膜上的T线和C线印迹,将样品垫、结合垫、NC膜、吸水纸按照一定的工艺固定在支持板上,从而制成了稀土荧光检测试纸。对稀土荧光检测试纸的性能进行了鉴定,其肉眼观测完全抑制限为1.6ng/mL,通过微型荧光读条仪可以进行定量检测,定量检测范围为0.04~1.27ng/mL,LOD为0.04ng/mL,较同抗体制备的胶体金试纸灵敏许多,具有较好的特异性,与同系物几乎无交叉,具有良好的重复性、准确性,有效期至少为6个月。选择具有优良发光性能的FITC为荧光材料,利用St ber法制备了掺杂型的FITC-SiO2纳米颗粒,该荧光纳米颗粒具有FITC的荧光特征峰,有较好的耐光性,不易发生荧光泄露。在TEM下,FITC-SiO2纳米颗粒呈现均匀的球状结构,粒径为96±6nm,具有较好的分散性。利用氧化后Dextran-500k的醛基将带氨基的FITC-SiO2纳米颗粒和CL-McAb联接,将FITC荧光抗体喷涂在结合垫上,分别选择CL-BSA和SPA作为NC膜上的T线和C线印迹,将样品垫、结合垫、NC膜、吸水纸按照一定的工艺固定在支持板上,从而制成了FITC荧光检测试纸。对FITC荧光检测试纸的性能进行了鉴定,其肉眼观测完全抑制限为6ng/mL,通过微型荧光读条仪可进行定量检测,定量检测范围为0.16~5.18ng/mL,LOD为0.16ng/mL,较同抗体制备的胶体金试纸灵敏,具有较好的特异性,与同系物几乎无交叉,具有良好的重复性、准确性,有效期至少为6个月。建立了检测猪尿样品中CL残留的GC-MS方法,其线性检测范围为0.10~500ng/mL,LOD为0.1ng/mL,该法灵敏、准确、稳定,需要昂贵的仪器设备,专门的操作人员,检测周期长,费用较高,无法做到现场高通量检测。比较分析了GC-MS、稀土荧光试纸和FITC荧光试纸对实际样品的测定结果,稀土荧光检测试纸与确证方法GC-MS的符合率为100%,FITC荧光检测试纸与确证方法GC-MS的符合率为97.6%,进一步确证了稀土荧光试纸和FITC荧光试纸检测CL残留具有较好的准确性、时效性。
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