【摘 要】
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卵母细胞生长发育紊乱导致的减数分裂受阻或染色体异常分离会影响受精和胚胎发育,甚至造成流产和胎儿畸形。然而,卵母细胞的发育受到内源性减数分裂复杂调控和颗粒细胞在内的外源性因素的多重影响,因此在分子水平揭示内源性和外源性因素的卵子发育调控机制对于改善家畜繁育和提高其繁殖力具有重要意义。小头畸形（microcephaly,MCPH）家族蛋白在有丝分裂和减数分裂中发挥着重要作用,其中WDR62（WD40-
【基金项目】
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国家自然科学基金（No.31972533）； 中央高校基本科研业务费专项资金（No.2662020DKPY011）；
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卵母细胞生长发育紊乱导致的减数分裂受阻或染色体异常分离会影响受精和胚胎发育,甚至造成流产和胎儿畸形。然而,卵母细胞的发育受到内源性减数分裂复杂调控和颗粒细胞在内的外源性因素的多重影响,因此在分子水平揭示内源性和外源性因素的卵子发育调控机制对于改善家畜繁育和提高其繁殖力具有重要意义。小头畸形（microcephaly,MCPH）家族蛋白在有丝分裂和减数分裂中发挥着重要作用,其中WDR62（WD40-repeat protein 62）可以通过参与中心粒复制和维持中心体的完整性,并对有丝分裂纺锤体形成以及细胞周期调控至关重要;同时,研究发现WDR62敲除小鼠表现为雌性完全不育,并伴随减数分裂起始异常、卵泡和生殖细胞的缺失。这表明WDR62在雌性生殖中发挥重要作用,但是WDR62在减数分裂成熟过程以及颗粒细胞中的功能尚不明确。本研究以小鼠为模型,通过小RNA干扰,分别敲低卵母细胞和颗粒细胞中WDR62的表达,并结合实时荧光定量PCR、免疫印迹、免疫荧光和激光共聚焦及染色体爬片等研究方法以探究WDR62在卵母细胞减数分裂成熟和颗粒细胞中的功能及机制。具体研究结果如下:1.WDR62在小鼠卵母细胞减数分裂成熟中的功能及机制研究（1）在生发泡时期（germinal vesicle stage,GV stage）的卵母细胞中,WDR62聚集在生发泡中,以生发泡破裂（germinal vesicle breakdown,GVBD）为标志的减数分裂恢复后,WDR62与染色体共定位。在减数分裂进程中WDR62均有表达,其中在GV期表达量最高,在减数第二次分裂中期（metaphase Ⅱ,MⅡ）表达量最低。（2）敲低WDR62后,不影响卵母细胞的GVBD（P＞0.05）,但是显著抑制卵母细胞的第一极体排放（PBE）（P＜0.05）,同时造成胞质不均等分裂异常,导致大极体的产生（P＜0.01）。（3）敲低WDR62后,会干扰p-JNK的定位（P＜0.001）,并造成其表达量降低（P＜0.05）,同时导致H3K9me3水平升高（P＜0.0001）,进而破坏纺锤体组装（P＜0.01）、染色体排列（P＜0.01）和动粒-微管连接（K-MT）结构（P＜0.01）,导致纺锤体组装检验点（SAC）持续激活,最终影响减数分裂周期进程。利用p-JNK特异性抑制剂SP600125处理,抑制卵母细胞中p-JNK的表达后,会造成相似的异常表型:H3K9me3水平升高（P＜0.0001）,同时纺锤体形态畸形（P＜0.001）、染色体排列异常（P＜0.001）,减数分裂进程紊乱。表明WDR62可以通过JNK信号通路参与调控减数分裂的成熟。（4）敲低WDR62后,导致Arp2/3复合物的定位异常（P＜0.01）和表达升高（P＜0.05）,造成Actin cap形成异常（P＜0.05）,影响纺锤体向皮质区的迁移（P＜0.01）,进而导致胞质不均等分裂异常。表明WDR62通过参与Arp2/3复合物的调控影响Actin的动态分布,来调节纺锤体迁移介导的胞质不均等分裂。2.WDR62在小鼠颗粒细胞中的功能及机制研究（1）WDR62在小鼠卵巢组织的卵母细胞和颗粒细胞中均有表达。（2）敲低WDR62后,导致PCNA的表达量下降（P＜0.0001）,进而降低颗粒细胞的数量（P＜0.001）和活力（P＜0.001）。（3）敲低WDR62后,导致促凋亡因子Bax的表达量上升（P＜0.05）,进而诱导颗粒细胞的凋亡（P＜0.05）。（4）敲低WDR62后,导致有丝分裂纺锤体调控因子AURKA（P＜0.01）和p-JNK（P＜0.001）的表达量降低,造成颗粒细胞周期紊乱,S期比例降低（P＜0.05）,G2期比例升高（P＜0.05）。（5）敲低WDR62后,导致颗粒细胞相关激素受体FSHR（P＜0.0001）和ERα（P＜0.05）的表达量降低,影响颗粒细胞的功能。上述结果表明WDR62通过调控增殖、凋亡和周期相关蛋白的表达以及颗粒细胞相关激素受体的表达,来调节颗粒细胞生理状态和功能。综上所述,WDR62缺失通过影响JNK信号通路和H3K9me3状态影响卵母细胞的成熟,并通过扰乱Arp2/3复合物的定位影响细胞骨架动力学,导致不均等分裂异常。此外,WDR62的缺失抑制颗粒细胞的增殖,诱导其凋亡,并影响其细胞周期进程和激素受体的表达。
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