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棉花是世界上最重要的经济作物之一。棉花黄萎病严重影响棉花产量和纤维品质,继而造成巨大的经济损失。传统的化学方法的防治并不能很好的解决这一问题。因此,培育棉花抗病品种成为解决该问题最有效、环保的途径。深入挖掘与利用棉花中重要的抗病基因功能和揭示棉花抗黄萎病分子机制,对加快棉花抗病分子育种进程,促进棉花产业发展具有重要的意义。在本课题组前期研究中,采用VIGS技术沉默棉花抗黄萎病候选基因GbDREB后初步发现棉花对黄萎病的抗性降低。为阐明GbDREB参与棉花黄萎病抗性反应的机理,本研究利用VIGS(病毒诱导基因沉默)等分子生物学技术开展了GbDREB基因的研究。通过构建特异性区段的VIGS载体,结果显示黄萎病菌侵染后沉默GbDREB棉花的发病率和病情指数均升高。对发病植株剖杆的实验结果也显示GbDREB沉默后植株的维管束褐化程度较对照组(TRV:00植株材料)严重。对TRV:GbDREB植株材料进行台盼蓝染色,结果显示着色比对照组深,以上结果表明GbDREB的沉默能够降低棉花对黄萎病菌的抗病性。构建过表达GbDREB载体转化拟南芥植株并筛选得到纯合体,通过伤根的方法侵染黄萎病菌,结果显示GbDREB的过表达转基因拟南芥植株与野生型植株均出现叶片萎蔫的症状,统计病情指数分别为50%(D6)、60.42%(D11)、58.12%(D1)和60%(WT),统计结果差异不显著。进一步的qRT-PCR实验检测病原菌响应基因AtPR3,AtPR4的表达水平,结果显示黄萎病菌侵染拟南芥3天(d)后,AtPR3,AtPR4的表达水平与野生型相比差异不显著。以上结果显示GbDREB在拟南芥中过表达并没有显著提高其抗病性。外源施加JA、SA、ETH均能诱导GbDREB的表达水平上调,而外源施加ABA和IAA时GbDREB的表达水平差异不显著。结果显示,JA、SA和ET可能参与GbDREB参与调控棉花的抗病反应过程。为了进一步探究GbDREB是如何参与调控棉花的抗病反应,利用酵母双杂交筛库实验筛选能够与GbDREB互作的上、下游基因。GbDREB蛋白在酵母体内是无毒的,但是有一定的自激活活性。通过截短片段验证结果显示,GbDREB蛋白的转录激活区域位于C端122-176氨基酸。与此同时,ERF(Ethyleneresponsive factor)亚家族的GbABR1基因通过前期的VIGS实验结果也证明其在棉花中对黄萎病的调控起到一定的作用。本研究进一步研究结果显示,受黄萎病菌诱导表达后,GbABR1在24小时(h)后开始上调表达,在3d时表达量达到最高,5 d后表达量依旧上调,随后表达量和对照组没有明显差异。过表达转基因拟南芥侵染病菌后,统计病情指数分别为67.96%(A9)、65.35%(A11)和60.96%(WT),结果显示GbABR1过表达后和野生型植株发病情况没有明显的差异。进行激素处理后,GbABR1快速响应JA和ETH的处理,说明该基因与这两个激素JA和ETH的交叉调控通路相关。进行自激活和毒性检测,该基因有明显的自激活作用,通过截短体验证结果显示,转录激活区域处位于C端293-370氨基酸。