【摘 要】
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作为极端环境之一,南极因其低温、高盐、强紫外、寡营养等自然环境特点而孕育出独特的生物资源,其中极端酶因可在极端条件下维持较高催化活性而被赋予工业应用价值。因此,对于南极生物资源的挖掘及其基因资源的改造,都已是国内外微生物资源开发领域的关注重点。3′(2′),5′-二磷酸核糖酶(BPntase,3′(2′),5′-Bisphosphate Nucleotidase)可参与生物体钠盐耐受调控过程,具有
【基金项目】
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国家自然科学基金(41876149); 山东省自然科学基金(ZR2021MD040);
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作为极端环境之一,南极因其低温、高盐、强紫外、寡营养等自然环境特点而孕育出独特的生物资源,其中极端酶因可在极端条件下维持较高催化活性而被赋予工业应用价值。因此,对于南极生物资源的挖掘及其基因资源的改造,都已是国内外微生物资源开发领域的关注重点。3′(2′),5′-二磷酸核糖酶(BPntase,3′(2′),5′-Bisphosphate Nucleotidase)可参与生物体钠盐耐受调控过程,具有重要的生理调控功能,在科研和医疗上具有重要应用价值。本文以南极盐杆菌Halomonas sp.L04为研究菌株,对其所携带的BPntase基因进行克隆与异源表达,通过从头建模和分子动态模拟研究重组BPntase(r BPntase)的酶学性质,丰富r BPntase结构信息,为其进一步研究提供科学依据。通过序列和建模分析可知,r BPntase的催化位点(Thr-93和Asp-216)高度保守,通过增加柔性结构占比与分子间相互作用力的方式增强结构柔性,维持在低温条件下较高的催化效率。在纯化的基础上,对r BPntase活性及结构变化进行分析。结果表明,r BPntase的最适催化温度为25℃。即使在0~10℃,仍能保留其初始活性的10%~30%,较高的kcat以及随温度升高而下降的?H和结合能有利于r BPntase在低温条件下维持较高的催化效率。通过rBPntase的低温钠盐浓度梯度模拟发现,较高的活性口袋柔性和负电荷残基的表面分布有利于其在盐溶液中维持活性构象,形成低温钠盐耐受性。此外,通过以RMSF和突变成Asp后的ΔΔG作为参考,筛选出了对2.0 M Na Cl溶液具有耐受性的突变体F31D。结果表明,F31D通过调整与底物间的相互作用力以及分子内外氢键数量的方式维持活性构象以及与底物的稳定结合。以上结果证实了Asp的合理置换对酶钠盐耐受性提升,尤其是钠盐敏感酶类的低温钠盐耐受性。总之,通过对适冷BPntase的结构及酶学性质分析,描述钠盐敏感酶类低温钠盐耐受性的结构特点以及维持催化活性的调控方式,为微生物、植物等的抗逆性研究和基因工程改造提供了理论依据。
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