目的近年来肿瘤新抗原作为免疫治疗的靶点备受关注,成为个体化免疫治疗的主力军。而共享新抗原因其在不同患者间通用,比个体化新抗原具有更广的适用性。本研究对TP53基因突变产生的共享新抗原进行氨基酸的替换修饰,探究改造后的共享新抗原是否能增强其免疫原性,从而更好地刺激和活化T细胞,进一步增强TP53共享新抗原的抗肿瘤作用,为肝癌患者以及存在相同突变的其他肿瘤患者提供更好的新抗原疫苗奠定基础。方法1.通过文献找出肝癌TP53基因热点突变,经抗原多肽预测算法获得共享新抗原,生物信息学软件预测共享新抗原的亲和力。选择亲和力较低的TP53-Y220C共享新抗原进行氨基酸残基改造。合成改造前TP53-Y220C新抗原和改造后TP53-Y220C（L2）新抗原,用T2细胞检测改造前、改造后新抗原的亲和力和稳定性。2.将合成的新抗原肽负载于树突状细胞（Dendritic cell,DC）中,并诱导细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic lymphocyte,CTL）。通过酶联免疫吸附测定法（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测干扰素-γ（Interferon-γ,IFN-γ）的分泌,通过CFSE染色于流式细胞仪上检测CTL细胞的增殖,乳酸脱氢酶（Lactic dehydrogenase,LDH）释放法检测不同新抗原刺激的CTL对负载TP53-Y220C新抗原T2细胞的杀伤。3.将改造前、改造后TP53-Y220C新抗原刺激活化的CTL作为效应细胞,选取存在或不存在TP53-Y220C新抗原突变位点的肝癌细胞作为靶细胞。在体外,通过LDH释放试验检测不同新抗原刺激的CTL对肿瘤细胞的杀伤。在体内,将肝癌细胞接种至斑马鱼卵黄囊内,然后注射不同新抗原刺激活化的CTL,24h后观察CTL对肝癌细胞的生长抑制情况。4.LDH试验检测不同新抗原刺激的CTL对含有或未含有TP53-Y220C新抗原突变位点的胃癌细胞、胰腺癌细胞、食管癌细胞的杀伤。ELISA法、酶联免疫斑点实验（Enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT）检测靶细胞和效应细胞共培养后IFN-γ、肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor,TNF-α）的释放情况。结果1.生物信息学软件预测结果显示,改造后TP53-Y220C（L2）新抗原的亲和力有提升。体外亲和力检测结果显示,改造前TP53-Y220C新抗原的亲和力为3.10±0.35,改造后TP53-Y220C（L2）新抗原的亲和力为3.61±0.31。稳定性检测结果显示,改造前TP53-Y220C新抗原的稳定性<18h,改造后TP53-Y220C（L2）新抗原的稳定性>18h,两者在12h和18h的解离率有显著差异（P<0.01）。2.T细胞增殖试验和ELISA试验结果显示,与改造前TP53-Y220C新抗原相比,改造后TP53-Y220C（L2）新抗原能刺激更多的T细胞增殖,分泌更多的IFN-γ。3.从交叉实验结果可见,改造前TP53-Y220C新抗原和改造后TP53-Y220C（L2）新抗原刺激的CTL均能识别提呈有TP53-Y220C新抗原的T2细胞。且与改造前相比,改造后新抗原刺激的CTL与T2细胞共培养后分泌更多的IFN-γ和TNF-α。4.肝癌体外杀伤结果提示,与改造前相比,改造后TP53-Y220C（L2）新抗原刺激的CTL能杀伤更多的肝癌细胞Hu H7-HLA-A0201,且IFN-γ和TNF-α的分泌量更多。斑马鱼试验显示,与改造前相比,改造后TP53-Y220C（L2）新抗原刺激的CTL能在24h内使斑马鱼体内的肝癌细胞荧光面积减少更多（P<0.01）。5.LDH释放试验结果显示,TP53-Y220C新抗原和TP53-Y220C（L2）新抗原刺激的CTL均能识别和杀伤存在TP53-Y220C突变位点的胃癌细胞、胰腺癌细胞、食管癌细胞,且TP53-Y220C（L2）新抗原刺激的CTL组分泌更多的IFN-γ和TNF-α。结论1.改造的TP53-Y220C（L2）新抗原比未改造的TP53-Y220C新抗原的亲和力有所增加,稳定性显著增加,并且具有更强的免疫原性,可以更好地刺激T细胞增殖。2.肝癌细胞的体外杀伤试验和斑马鱼体内试验证明,TP53-Y220C（L2）新抗原活化的CTL比TP53-Y220C新抗原活化的CTL对肝癌细胞具有更好的细胞毒性。3.TP53-Y220C（L2）新抗原和TP53-Y220C新抗原活化的CTL对存在TP53-Y220C突变新抗原的胃癌细胞、胰腺癌细胞、食管癌细胞均有杀伤,且改造新抗原刺激的CTL可诱导更强的杀伤活性。说明TP53-Y220C新抗原符合共享新抗原特性,亲和力和稳定性增强的TP53-Y220C（L2）新抗原有望作为多种肿瘤的DC疫苗或者多肽疫苗用于抗肿瘤免疫治疗。